響應曲面法優化微生物降解長焰煤工藝條件

李建濤，劉向榮，王 靜，徐云龍

(1.西安科技大學化學與化工學院，陜西 西安 710054；2.商洛學院化學工程與現代材料學院，陜西 商洛 726000)

響應曲面法優化微生物降解長焰煤工藝條件

李建濤1,2，劉向榮1*，王 靜1，徐云龍1

(1.西安科技大學化學與化工學院，陜西 西安 710054；2.商洛學院化學工程與現代材料學院，陜西 商洛 726000)

選擇4種細菌降解寶雞麟游長焰煤，通過菌-煤匹配降解實驗篩選出優勢降解菌；在單因素實驗的基礎上，以接種量(A)、氧化程度(B)、降解時間(C)為自變量，以降解轉化率為響應值，采用響應曲面法對多粘類芽孢桿菌降解長焰煤的工藝條件進行了優化研究。結果表明，優勢降解菌為多粘類芽孢桿菌；影響降解轉化率的多元二次方程模型為η=45.22+5.75A+10.24B+16.64C+5.43AC+5.35BC-7.84A2-9.67B2-13.02C2，R2=0.9779，失擬值為0.1565，失擬誤差不顯著；氧化程度和降解時間對降解轉化率影響非常顯著，接種量影響不顯著，3個因素間的交互作用影響不顯著；接種量、氧化程度、降解時間的最佳值分別為7.08 mL·(50 mL)-1、7.58 mol·L-1、9.84 d，對應的最大降解轉化率為 59.14%，在此條件下進行驗證實驗得到降解轉化率為58.87%，與模型預測值相差較小，表明所得模型能夠較好地預測實際降解效果。

長焰煤；多粘類芽孢桿菌；降解；響應曲面法

我國煤炭儲量居世界第三，消費量居世界第一。我國煤炭消費量占能源總消費量的60%以上。按照我國煤階的劃分方法，低階煤主要為褐煤、長焰煤、不粘煤、弱粘煤等，其特點是熱值低，水分、灰分、腐植酸含量相對較高，側鏈及含氧官能團較多，含氧量為15%～30%，不適合直接作為燃料，而現有技術大多不能清潔高效地利用低階煤資源，易造成資源浪費和環境污染[1-4]。由于低階煤含有豐富的類木質素結構，分子中的側鏈、橋鍵、活性官能團較多，使得低階煤易于被微生物降解。微生物降解是一種清潔利用低階煤的新技術，其條件溫和、能耗低、污染小，降解所得產物可用于工業、農業、醫學等多個領域[5-7]。我國低階煤儲量占比高達55%[8]，因此，利用微生物降解低階煤具有極大的優越性和廣闊的前景，受到研究人員的高度重視與關注。

鑒于此，作者選擇4種具有煤炭降解能力的細菌，用于降解寶雞麟游長焰煤，旨在確定菌-煤匹配關系，并通過響應曲面法對優勢菌降解寶雞麟游長焰煤的工藝條件進行優化，以獲得最佳降解工藝條件和模型方程，并對降解過程影響因素的顯著性進行評價。

1 實驗

1.1 材料、菌種與培養基

寶雞麟游長焰煤原煤，水分6.96%、灰分12.78%、揮發分 45.65%、固定碳34.61%，元素分析：C 64.50%、H 8.15%、O 12.67%、N 0.82%、 S 1.08%，屬低灰分、高揮發分、中低固定碳煤；C、H含量較低，O含量較高，為低變質程度煤。原煤經破碎、球磨、過篩制得粒徑分別為1 700～2 360 μm、880～1 700 μm、550～880 μm的煤樣，備用。

蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)、多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)，中國工業微生物菌種保藏管理中心；鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、金黃色葡萄球菌(StaphyloccocusaureusRosenbach)，中國普通微生物菌種保藏管理中心。

牛肉蛋白胨培養基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，蒸餾水1.0 L，自然pH值6.62。

馴化培養基Ⅰ：牛肉蛋白胨培養基的基礎上加1.0 g硝酸氧化的長焰煤，自然pH值6.72。

馴化培養基Ⅱ：牛肉蛋白胨培養基的基礎上加2.0 g硝酸氧化的長焰煤，自然pH值6.86。

1.2 煤樣的預處理

分別用4 mol·L-1、6 mol·L-1、8 mol·L-1的硝酸將3種粒徑煤樣按煤樣質量與硝酸體積比1.0∶2.5(g∶mL)的比例攪拌均勻，浸泡氧化24 h，抽濾，用去離子水沖洗至濾液pH值為7左右，烘干，于121 ℃、0.1 MPa高壓滅菌20 min，備用[9-11]。為了利于實際作業，本實驗以硝酸濃度表示煤樣的氧化程度。

1.3 細菌的復活及馴化

復活：煤樣、所用儀器全部滅菌。取4支試管，各裝入10 mL牛肉蛋白胨培養基，分別接入蘇云金芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，接好菌的試管置于28 ℃恒溫培養箱中160 r·min-1振蕩培養48 h[12]。

馴化：將復活的4種細菌分別接種到盛有10 mL馴化培養基Ⅰ的4支試管中，于28 ℃恒溫培養箱中160 r·min-1振蕩培養48 h；再將一代馴化細菌分別接種到盛有10 mL馴化培養基Ⅱ的4支試管中，于28 ℃恒溫培養箱中160 r·min-1振蕩培養48 h，備用。

1.4 優勢降解菌的篩選

取12支試管，分為4組，每支試管均加入氧化程度為8 mol·L-1、粒徑為1 700～2 360 μm的長焰煤樣0.1000 g，滅菌；調節4種馴化菌液濃度為5×105CFU·mL-1；分別在4組試管中加入4種菌液各10 mL；另取3支試管，加入10 mL培養基和等量滅菌的煤樣，作為空白對照。將5組試管置于恒溫培養箱中，于28 ℃、160 r·min-1振蕩培養14 d；抽濾于錐形瓶中，加入玻璃珠和適量去離子水高速攪拌，使菌絲體和煤樣充分分離；離心，去除漂浮菌絲體的上層液體，過濾；濾渣加適量去離子水攪拌，離心，去除漂浮菌絲體的上層液體，如此反復直至菌絲體去除干凈；烘干，稱重，按式(1)[13-14]計算降解轉化率(η)，取平均值。以降解轉化率最大者為優勢降解菌，用于后續實驗。

(1)

式中：m為煤樣的初始質量，g；m1為降解后殘余煤渣質量，g。

1.5 優勢菌降解長焰煤工藝優化

1.5.1 單因素實驗

以篩選得到的優勢菌按1.4方法降解長焰煤，以降解轉化率為考核指標，以煤樣粒徑、氧化程度、煤漿濃度、接種量、降解時間、降解溫度、振蕩轉速為考察因素設定不同取值進行降解工藝優化單因素實驗，每一個設定值做3個平行實驗。

1.5.2 響應曲面法實驗

在單因素實驗的基礎上，選擇接種量、氧化程度、降解時間為自變量，以降解轉化率為響應值，用Box-Behnken設計實驗，用Design-Expert 8.0軟件進行響應曲面分析，進一步優化微生物降解長焰煤工藝條件。

2 結果與討論

2.1 優勢降解菌的篩選結果

圖1是4種細菌降解長焰煤的轉化率。

圖1 4種細菌降解長焰煤的轉化率Fig.1 Conversion rates of long flame coal degradedby four bacteria

由圖1可以看出，4種細菌都能不同程度地降解長焰煤，降解能力大小依次為：多粘類芽孢桿菌>蘇云金芽孢桿菌>鼠傷寒沙門氏菌>金黃色葡萄球菌，其中，多粘類芽孢桿菌的降解能力最強。因此，選擇多粘類芽孢桿菌為降解長焰煤的優勢菌，用于后續實驗。

2.2 單因素實驗結果

單因素實驗確定的多粘類芽孢桿菌降解長焰煤的工藝條件為：煤樣粒徑550～880 μm、氧化程度8 mol·L-1、煤漿濃度0.75 g·(50 mL)-1、接種量5 mL·(50 mL)-1、降解時間7 d、降解溫度30 ℃、振蕩轉速180 r·min-1。

2.3 響應曲面法實驗結果

2.3.1 實驗方案設計

對單因素實驗結果進行分析，發現煤樣粒徑、氧化程度、煤漿濃度、接種量和降解時間5 個因素對降解轉化率影響較大，為主要影響因素。但對于煤樣粒徑，前期大量實驗證明對一定量的煤樣而言，粒徑越小，降解轉化率越高，原因可能是相同質量的煤樣，粒徑越小，表面積越大，煤樣和細菌的接觸面就越大，也就是說單位時間內煤樣和細菌產生的溶煤物直接接觸的幾率越大，溶煤效果越好；但煤樣過細，又會使得產物中菌絲體和細小的煤樣粘附在一起難以分離，導致通過式(1)計算的降解轉化率失真，不能用式(1)定量評判細菌對長焰煤的降解效果。另外，煤漿濃度和煤樣粒徑緊密相關，故僅對接種量、氧化程度和降解時間進行響應曲面法優化，其它因素按單因素實驗確定的工藝條件取值。

2.3.2 Box-Behnken設計實驗結果與分析

以接種量、氧化程度和降解時間為自變量，以降解轉化率為響應值，用Box-Behnken 進行實驗設計，結果見表1。

表1Box-Behnken設計實驗結果

Tab.1Results of Box-Behnken design experiment

由表1可知，3個因素對降解轉化率均有顯著影響。因此，研究各因素水平的最佳組合，進而建立降解轉化率的預測模型具有實際意義。

根據表1數據，利用 Design-Expert 8.0 軟件進行響應曲面分析，得到降解轉化率與各因素間多種模型的方差分析及R2的綜合分析，結果見表2和表3。

由表2、3可知，經F檢驗，軟件系統給出如下模型：線性、雙因素、二次和三次方程，其中，以二次方程模型為最適模型。對回歸二次方程模型方差來源與顯著性進行分析，結果見表4。

表2多種模型的方差分析

Tab.2Variance analysis for models

表3模型綜合分析

Tab.3Model summary statistics

表4回歸二次方程模型方差來源與顯著性分析

Tab.4Variance source and significant

注：＊＊表示非常顯著(P<0.001)，＊表示不顯著(P>0.001)。

在二次方程模型中，因素A(接種量)對響應值η的影響不顯著；因素B(氧化程度)對響應值η的影響非常顯著；因素C(降解時間)對響應值η的影響非常顯著；二次項C2對響應值η的影響非常顯著，而A2、B2對響應值η影響不顯著；交互項AB、AC、BC對響應值η的影響均不顯著，且由于AB的交互作用對η的影響甚微，軟件沒有給出分析數據。

2.3.3 擬合模型的建立

根據以上分析，對多元二次方程進行回歸擬合，建立模型方程為：η=45.22+5.75A+10.24B+16.64C+5.43AC+5.35BC-7.84A2-9.67B2-13.02C2。

圖2為煤樣降解轉化率標準曲線殘差概率與內學生化殘差概率的擬合曲線。

圖2 煤樣降解轉化率標準曲線殘差概率與內學生化殘差概率的擬合曲線Fig.2 Fitted curve of normal probability and internallystudentized residual for degradation conversion rateof long flame coal

由圖2可以看出，標準曲線具有較好的擬合性，因此可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析。

2.3.4 交互作用分析

利用Design-Expert 8.0軟件對回歸模型進行響應曲面分析，得到3個因素間交互作用關系的等值線與響應面，如圖3所示。由于接種量和氧化程度之間的交互作用甚微，軟件沒有給出二者之間的等值線圖和響應面圖。

由圖3可直觀地看出，接種量、氧化程度和降解時間之間的交互作用不顯著。

2.3.5 最優工藝驗證

軟件給出了43種可能的組合方式，最大響應值(59.14%)時接種量、氧化程度、降解時間的最佳值為：7.08 mL·(50 mL)-1、7.58 mol·L-1、9.84 d。在該條件下進行驗證實驗，得到的降解轉化率為58.87%，與預測值相差較小，表明該模型可較好地預測實際降解效果。

圖3 三因素交互作用的等值線與響應面Fig.3 Contour and response surface of the interaction among three factors

3 結論

選擇4種具有煤炭降解能力的細菌降解長焰煤，通過菌-煤匹配降解實驗確定優勢菌為多粘類芽孢桿菌；在單因素實驗的基礎上，利用 Box-Behnken設計響應曲面法實驗，擬合得到影響多粘類芽孢桿菌降解長焰煤轉化率的多元二次回歸方程模型為：η=45.22+5.75A+10.24B+16.64C+5.43AC+5.35BC-7.84A2-9.67B2-13.02C2。氧化程度(B)和降解時間(C)對降解轉化率的影響均非常顯著，接種量(A)影響不顯著。確定多粘類芽孢桿菌降解寶雞麟游長焰煤的最佳條件為：接種量7.08 mL·(50 mL)-1、氧化程度7.58 mol·L-1、降解時間9.84 d、煤樣粒徑550～880 μm、煤漿濃度0.75 g·(50 mL)-1、降解溫度30 ℃、振蕩轉速180 r·min-1，在此條件下，降解轉化率可達59.14%。驗證實驗所得實際降解轉化率為58.87%，與模型預測值相差較小，表明所建立模型可較好預測實際降解效果。

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ProcessOptimizationinMicrodegradationofLongFlameCoalbyResponseSurfaceMethodology

LI Jian-tao1,2,LIU Xiang-rong1*,WANG Jing1,XU Yun-long1

(1.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,Xi′anUniversityofScienceandTechnology,Xi′an710054,China;2.CollegeofChemicalEngineeringandModernMaterials,
ShangluoUniversity,Shangluo726000,China)

We screened a superior strain from four bacteria by degradation matching experiments of Baoji Linyou long flame coal.Based on single-factor experiment,using inoculum(A),oxidation degree(B),and degradation time(C) as variables,the degradation conversion rate as responsible value,we optimized the degradation conditions of long flame coal withPaenibacilluspolymyxaby response surface methodology.The results indicated that the superior strain wasPaenibacilluspolymyxa,the multi-quadratic equation model wasη=45.22+5.75A+10.24B+16.64C+5.43AC+5.35BC-7.84A2-9.67B2-13.02C2,R2=0.9779,and the lack of fit was 0.1565,not significant.Meanwhile,we found the oxidation degree and degradation time were the significant factors for the degradation conversion rate,but inoculum and the interactions among three factors were not significant.The optimum values of inoculum,oxidation degree,and degradation time were 7.08 mL·(50 mL)-1,7.58 mol·L-1,and 9.84 d,respectively,while the corresponding degradation conversion rate was 59.14%.Under the optimum conditions,the degradation conversion rate of verification experiment was 58.87%,which was slightly different from the predicted value,furthermore,the obtained model was able to predict practical situation.

long flame coal;Paenibacilluspolymyxa;degradation;response surface methodology

TQ536.9 TD984

A

1672-5425(2017)10-0032-05

國家自然科學基金項目(21373158)，陜西省科技廳中澳合作項目(2013KW17)

2017-05-15

李建濤(1979-)，男，陜西商州人，講師，博士，研究方向：煤的轉化和綜合利用，E-mail:287652734@qq.com；通訊作者：劉向榮，教授，E-mail：liuxiangrongxk@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.10.007

李建濤，劉向榮，王靜，等.響應曲面法優化微生物降解長焰煤工藝條件[J].化學與生物工程，2017，34(10)：32-36.