漢防己甲素對(duì)人絨毛膜癌BeWo細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響*

方 靜,冀 靜,安瑞芳

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科(西安 710061)

·基礎(chǔ)研究·

漢防己甲素對(duì)人絨毛膜癌BeWo細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響*

方 靜,冀 靜,安瑞芳

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科(西安 710061)

目的：探討漢防己甲素對(duì)人絨毛膜癌BeWo細(xì)胞株凋亡和細(xì)胞周期的影響。方法：以不同濃度的漢防己甲素處理人絨毛膜癌BeWo細(xì)胞株24 h，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化；Western blot檢測(cè)p53和p21蛋白的表達(dá)。結(jié)果：漢防己甲素處理后,BeWo細(xì)胞株凋亡細(xì)胞的比例明顯增高 (P<0.01),細(xì)胞周期G0/G1期細(xì)胞增加(P<0.01),S期細(xì)胞減少(P<0.01),p53和p21蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.01)。結(jié)論：漢防己甲素可以對(duì)絨毛膜癌BeWo細(xì)胞株發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡及細(xì)胞周期阻滯的作用，有望成為絨毛膜癌化療方案的輔助治療藥物。

妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病(Gestational trophoblastic disease,GTD)是一組來(lái)源于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的疾病，包括葡萄胎(Hydatidiform mole，HM)，侵蝕性葡萄胎(Invasive mole,IM)、絨毛膜癌(Choriocarcinoma,CC)和胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤(Placental site trophoblastic tumor,PSTT)等，后三者為惡性病變，被統(tǒng)為妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤(Gestational trophoblastic tumor,GTT)，其中絨毛膜癌惡性程度極高，在化療藥物問(wèn)世以前，其病死率高達(dá)90%以上，嚴(yán)重威脅育齡期婦女的健康狀況[1]。GTT是首個(gè)而且唯一一個(gè)對(duì)化療藥物敏感的實(shí)體瘤，有效的化療使絨毛膜癌的治愈率達(dá)到90%[2]，然而仍然有10%的患者對(duì)化療耐藥，因此尋求新的治療藥物具有極其重要的意義。漢防己甲素(Tetrandrine,TET)又稱粉防己堿，屬于雙芐基異喹啉類生物堿，自中草藥粉防己的塊莖中提取。近年來(lái)對(duì)于膀胱癌、肺癌、肝癌、胃癌和白血病的研究證實(shí)，漢防己甲素有抗腫瘤作用，機(jī)制可能是抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，發(fā)生細(xì)胞周期阻滯等[3-6]。研究還發(fā)現(xiàn)，漢防己甲素可以聯(lián)合化療藥物，促進(jìn)化療效果[7-8]。但是關(guān)于漢防己甲素用于絨毛膜癌的治療效果目前未見報(bào)道。本研究中我們采用不同濃度的漢防己甲素處理人絨毛膜癌BeWo細(xì)胞株，在不同的時(shí)間檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化，同時(shí)檢測(cè)p53和p21蛋白的表達(dá)，旨在探討漢防己甲素對(duì)人絨毛膜癌BeWo細(xì)胞株凋亡和細(xì)胞周期的影響。

材料與方法

1 細(xì)胞株和試劑 人絨毛膜癌BeWo細(xì)胞株購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，Ham/F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。漢防己甲素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，溶于二甲基亞砜(DMSO)中，使用前用培養(yǎng)基稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度。p21和p53抗體購(gòu)自于Santa Cruz生物公司。

2 細(xì)胞培養(yǎng) 人絨毛膜癌BeWo細(xì)胞株用含15%胎牛血清的Ham/F12培養(yǎng)基,在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),以1.25 g/L 胰酶和0.2 g/L 乙二胺四乙酸(EDTA)的混合液消化傳代。

3 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BeWo細(xì)胞株，常規(guī)消化，制成細(xì)胞懸液，以1×107細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，更換含有不同濃度漢防己甲素(5、10、20 μg/ml)的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞；以冰磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細(xì)胞，離心，加入1×結(jié)合緩沖液400 μl重懸細(xì)胞，然后加入Annexin-V-FITC 5 μl，4℃避光放置15 min；加入PI10 μl，4℃避光放置5 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的凋亡率。

4 細(xì)胞周期檢測(cè) BeWo細(xì)胞株種植于6 cm培養(yǎng)皿中,以含不同濃度漢防己甲素(5、10、20 μg/ml)的培養(yǎng)基處理24 h,收集細(xì)胞,以70%冰乙醇固定,4 μg/ml PI溶液染色30 min后上流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。

5 Western blot檢測(cè) 以不同濃度的漢防己甲素(5、 10、 20 μg/ml)處理BeWo細(xì)胞株24 h后提取蛋白。12% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%牛奶室溫封閉1 h，加一抗(p21和p53),4℃孵育過(guò)夜，二抗孵育1 h后采用化學(xué)熒光法顯色。GAPDH用做內(nèi)參。

結(jié) 果

1 漢防己甲素對(duì)BeWo細(xì)胞凋亡的影響 見圖1。收集不同濃度漢防己甲素處理24 h的BeWo細(xì)胞，通過(guò)Annexin V-FITC/PI染色法，檢測(cè)漢防己甲素處理后BeWo細(xì)胞的凋亡情況。在5、10、20 μg/ml漢防己甲素作用24 h后，BeWo細(xì)胞凋亡的比例分別為(7.98±2.31)%,(14.74±3.27)%和(28.87±3.69)%，而對(duì)照組(0 μg/ml)細(xì)胞的凋亡比例為(3.35±0.59)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=48.593，P<0.01)，表明隨著漢防己甲素濃度的增加，凋亡細(xì)胞的比例也增加。

圖1 漢防己甲素對(duì)BeWo細(xì)胞凋亡的影響

2 漢防己甲素對(duì)BeWo細(xì)胞周期的影響 見圖2。收集不同濃度漢防己甲素處理24 h的BeWo細(xì)胞，然后對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。結(jié)果顯示，漢防己甲素(5、10、20 μg/ml)濃度組作用于BeWo細(xì)胞24 h后,細(xì)胞在G0/G1期的比率隨之增高,阻滯細(xì)胞進(jìn)入S 期,故S期細(xì)胞比例下降，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FG0/G1=16.486,FS=14.425,P均<0.01)。說(shuō)明漢防己甲素阻滯細(xì)胞在G0/G1期,細(xì)胞增殖活動(dòng)受到抑制。

圖2 漢防己甲素對(duì)BeWo細(xì)胞周期的影響

3 p53和p21蛋白表達(dá)的變化 見圖3。采用Western blot方法，檢測(cè)不同濃度漢防己甲素處理24 h后BeWo細(xì)胞株中相關(guān)蛋白的表達(dá)。5、10、20 μg/ml漢防己甲素處理24 h后，p21蛋白表達(dá)水平依次為(0.47±0.05)，(0.66±0.07)，(0.85±0.08)，對(duì)照組為(0.05±0.01)(F=107.685，P<0.01)；p53蛋白表達(dá)水平分別為(0.57±0.06)，(0.83±0.09)，(0.92±0.07)，對(duì)照組為(0.31±0.03)(F=51.903，P<0.01)，均明顯升高。

圖3 p53和p21蛋白表達(dá)的變化

討 論

絨毛膜癌是一種高度惡性的妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤，主要發(fā)生于育齡期婦女，其特點(diǎn)是滋養(yǎng)細(xì)胞失去原來(lái)絨毛或葡萄胎的結(jié)構(gòu)，而散在的侵入子宮肌層，不僅造成局部嚴(yán)重破壞，并轉(zhuǎn)移至其他臟器或組織。自從有效化學(xué)藥物治療開始后，絨毛膜癌的病死率由過(guò)去的90%逐步下降到10%。也就是說(shuō)，仍有10%的患者對(duì)化療耐藥，針對(duì)化療耐藥患者，探索新的二線治療藥物具有極為重要的意義。

我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥的臨床應(yīng)用由來(lái)已久，漢防己甲素就被認(rèn)為是一種較為安全的中藥。最近的研究發(fā)現(xiàn)漢防己甲素具有抗腫瘤作用，其抗腫瘤作用的主要機(jī)制包括抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞周期阻滯等[9-10]。但是關(guān)于漢防己甲素對(duì)于人絨毛膜癌細(xì)胞株的作用目前尚無(wú)人研究。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，漢防己甲素可以誘導(dǎo)絨毛膜癌BeWo細(xì)胞株的凋亡，并使細(xì)胞周期阻滯在G1期，而且隨著漢防己甲素濃度的增加，其效果更加明顯，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。研究結(jié)果提示漢防己甲素可以通過(guò)影響B(tài)eWo細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，而且漢防己甲素水平在微克范圍內(nèi)已經(jīng)表現(xiàn)出對(duì)絨毛膜癌的治療具有良好的應(yīng)用前景。

為了進(jìn)一步探討粉防己堿促進(jìn)絨毛膜癌細(xì)胞株凋亡及發(fā)生細(xì)胞周期阻滯的機(jī)制,我們研究了與腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)的基因表達(dá)水平的變化。p53是一種抑癌基因，作為一個(gè)重要的調(diào)控因子,p53 蛋白能夠抑制腫瘤的生物學(xué)行為，抑制腫瘤新生血管的生成，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡；p53 還可以調(diào)控細(xì)胞周期,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞G0/G1期阻滯[11]。p21 是p53下游的信號(hào)分子，p21作為重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，是Cip /Kip家族中的重要成員，可以和大多數(shù)Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合并使其失活，使Rb 蛋白磷酸化水平下降，非磷酸化的Rb 蛋白在細(xì)胞中累積，引起細(xì)胞G0/G1期阻滯，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞的增殖[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中，漢防己甲素可以誘導(dǎo)p53和p21的活化，并最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)漢防己甲素使BeWo細(xì)胞株p53和p21蛋白表達(dá)水平上調(diào)，提示漢防己甲素可能通過(guò)調(diào)控上述基因而誘導(dǎo)絨毛膜癌細(xì)胞株凋亡及細(xì)胞周期阻滯。

綜上所述，本研究表明漢防己甲素在微克水平即可以對(duì)絨毛膜癌BeWo細(xì)胞株發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡及細(xì)胞周期阻滯的作用，這一作用可能是通過(guò)上調(diào)p53和p21蛋白表達(dá)水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究為絨毛膜癌治療提供了新的思路，漢防己甲素有望成為絨毛膜癌化療方案的輔助治療藥物，用于絨毛膜癌的治療。

[1] Seckl MJ, Sebire NJ, Berkowitz RS. Gestational tropoblastic disease [J]. Lancet, 2010, 376(4): 717-729.

[2] Lurain JR.Gestational trophoblastic disease II: classification and management of gestational trophoblastic neoplasia [J]. Am J Obstet Gynecol, 2011, 204(1)：11-18.

[3] Li X, Su B, Liu R,etal. Tetrandrine induces apoptosis and triggers caspase cascade in human bladder cancer cells [J]. J Surg Res, 2011, 166(1): e45-51.

[4] Ting CT, Li WC, Chen CY,etal. Preventive and therapeutic role of traditional Chinese herbal medicine in hepatocellular carcinoma [J]. J Chin Med Assoc, 2015, 78(3):139-144.

[5] Qin R, Shen H, Cao Y,etal. Tetrandrine induces mitochondria-mediated apoptosis in human gastric cancer BGC-823 cells [J]. PLoS One, 2013, 8(10): e764-786.

[6] Chen Y, Li P, Yang S,etal. Tetrandrine enhances the anticancer effects of arsenic trioxide in vitro [J]. Int J Clin Pharmacol Ther, 2014, 52(5):416-424.

[7] Liu W, Zhang J, Ying C,etal. Tetrandrine combined with gemcitabine and Cisplatin for patients with advanced non-small cell lung cancer improve efficacy [J]. Int J Biomed Sci, 2012, 8(1):28-35.

[8] Wang TH, Wan JY, Gong X,etal. Tetrandrine enhances cytotoxicity of cisplatin in human drug-resistant esophageal squamous carcinoma cells by inhibition of multidrug resistance-associated protein 1 [J]. Oncol Rep, 2012, 28(5)：1681-1686.

[9] Chen T, Ji B, Chen Y. Tetrandrine triggers apoptosis and cell cycle arrest in human renal cell carcinoma cells [J]. J Nat Med, 2014, 68(1): 46-52.

[10] Bhagya N, Chandrashekar KR. Tetrandrine-A molecule of wide bioactivity [J]. Phytochemistry,2016,125：5-13.

[11] Bizarro A, Ferreira IC, Sokovi M,etal. Cordyceps militaris (L.) link fruiting body reduces the growth of a non-small cell lung cancer cell line by increasing cellular levels of p53 and p21[J]. Molecules, 2015, 20(8): 13927-13940.

[12] Hu H, Dong Z, Tan P,etal. Antibiotic drug tigecycline inhibits melanoma progression and metastasis in a p21 CIP1 /Waf1-dependent manner [J]. Oncotarget, 2016, 7( 3): 3171-3185．

[13] Chen KH, Dasgupta A, Ding J,etal. Role of mitofusin2 (Mfn2) in controlling cellular proliferation [J]. J Faseb,2014,28(1): 382-394．

[14] Meng LH, Zhang H, Hayward L,etal. Tetrandrine induces early G1 arrest in human colon carcinoma cells by down-regulating the activity and inducing the degradation of G1-S-speicfic cyclin-dependent kinases and by inducing p53 and p21cip1[J]. Cancer Res,2004, 64(24): 9086-9092.

EffectsofTetrandrineonapoptosisandcellcycleofhumanchoriocarcinomaBeWocells

Fang Jing, Ji Jing, An Ruifang.

Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University (Xi’an 710061)

Objective: To study the effects of Tetrandrine on apoptosis and cell cycle of human choriocarcinoma BeWo cells. Methods: BeWo cells were treated with various concentrations of Tetrandrine for 24 h. Flow cytometry was used to analyze the apoptosis and cell cycle. Western blot was used to detect the expression of p53 and p21. Results: After treatment of Tetrandrine, the apoptosis rate of BeWo cells was increased significantly (P<0.01). The G0/G1phase cell increased, and the S phase cell decreased (P<0.01). The expression of p53 and p21 were increased (P<0.01). Conclusion：Tetrandrine can induce apoptosis and cell cycle arrest in human choriocarcinoma BeWo cells. It can be further used as an adjuvant agent for choriocarcinoma chemotherapy.

Choriocarcinoma Apoptosis Cell cycle @Tetrandrine

*陜西省國(guó)際科技合作與交流計(jì)劃項(xiàng)目(2013KW-27-01)

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(XJJ2015094)

絨毛膜癌 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞周期 @漢防己甲素

R737.33

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.001

(收稿：2017-01-03)