核轉錄因子NF-κB、RET/PTC在橋本甲狀腺炎合并甲狀腺乳頭狀癌中的表達及其意義*

李建英，王娟紅，魚 軍，牛 健，李秀萍，張 毓，陳 巍

西安市中心醫院(西安 710003)

△通訊作者

核轉錄因子NF-κB、RET/PTC在橋本甲狀腺炎合并甲狀腺乳頭狀癌中的表達及其意義*

李建英，王娟紅△，魚 軍，牛 健，李秀萍，張 毓，陳 巍

西安市中心醫院(西安 710003)

目的：探討核轉錄因子NF-κB與RET/PTC在橋本甲狀腺炎(HT)合并甲狀腺乳頭狀癌(PTC)患者中的表達、兩者的相關性及其可能的致癌機制。方法：對20例HT，20例PTC、15例HT合并PTC患者手術切除的甲狀腺組織及18例甲狀腺腺瘤患者腺瘤旁正常甲狀腺組織(NTT)用免疫組織化學(IHC)方法檢測RET/PTC癌基因和NF-κB p65蛋白表達情況，并研究兩者表達的相關性；用免疫熒光雙標記法和激光共聚焦顯微鏡檢測并觀察NF-κB與RET/PTC的共表達情況。結果：IHC結果顯示HT、HT合并PTC、PTC中RET/PTC陽性率分別為30%(6/20)、60%(9/15)和65%(13/20)，NF-κB p65 陽性率分別為90%(18/20，9例核轉位)、93.3%(14/15，13例出現核轉位)和95%(19/20，16例出現核轉位)，18例NTT中RET/PTC癌基因蛋白表達均為陰性，NF-κB 陽性率為27.8%(5/18，無1例出現核轉位)。RET/PTC和NF-κB p65在HT、HT合并PTC和PTC中的表達均顯著高于NTT組(均P<0.05)，而且NF-κB p65的表達及活化和RET/PTC蛋白的表達密切相關(P<0.01)。免疫熒光雙標記和激光共聚焦顯微鏡檢測結果顯示NF-κB與RET/PTC共表達于HT及PTC病變甲狀腺濾泡上皮細胞內。結論：HT及PTC患者甲狀腺組織中RET/PTC與NF-κB均顯著高于NTT，兩者表達與活化相關且共表達于甲狀腺濾泡上皮細胞內，提示核轉錄因子NF-κB p65可能通過RET/PTC活化在橋本甲狀腺炎濾泡上皮癌變中發揮重要的作用。

橋本甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis，HT)是世界范圍內最常見的器官特異性自身免疫性疾病之一[1]，大量的臨床觀察和實驗研究發現HT與甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma，PTC)關系密切[2]。HT中甲狀腺濾泡上皮細胞可發生癌變[3]。RET/PTC癌基因重排通常被認為是PTC發生的特征性基因[4]，但是在HT非癌性甲狀腺濾泡上皮細胞中該基因的檢出率也非常高，甚至達到90%以上[5]，說明RET癌基因重排是HT癌變的分子學基礎。核轉錄因子NF-κB(NF-κB)可調節細胞增殖基因及抗凋亡基因的表達，在腫瘤的發生中具有重要作用[6]。有研究發現RET/PTC癌基因產物可以誘導NF-κB的活化[7-8]，推測NF-κB p65活化及過表達在甲狀腺上皮細胞的惡性轉化過程中起著很重要的作用[9]。然而，HT患者易患PTC的機理至今仍不十分明了，本研究旨在通過檢測HT及PTC中RET/PTC癌基因蛋白表達及其與NF-κB表達活化的關系及共表達情況，進一步探討NF-κB p65在HT癌變中的作用及機制。

材料與方法

1 標本來源 20例HT，15例HT合并PTC，20例PTC石蠟組織標本均來自西安市中心醫院病理科2010-2014年存檔蠟塊。其中，女49例，男6例，年齡24～74歲，平均年齡43.3歲。同期18例甲狀腺腺瘤旁正常甲狀腺石蠟組織標本作為對照組(NTT)，其中，女17例，男1例，年齡25～67歲，平均年齡46.5歲。

2 主要試劑 鼠抗人RET/PTC癌基因單抗、鼠抗人NF-κB p65單抗及兔抗人NF-κB p65多克隆抗體均購自美國Santa Cruz 公司，Texas Red標記的羊抗兔二抗及FITC標記的羊抗鼠二抗均購自丹麥DAKO公司，SP試劑盒購自福州邁新公司，DAB顯色試劑盒購自武漢博士德公司。

3 實驗方法 ①免疫組化檢測RET/PTC和NF-κB蛋白表達：免疫組化染色采用常規鏈霉菌素親生物素-過氧化酶連接法(SP法)。RET/PTC單抗1∶100稀釋，NF-κB p65單抗1∶400稀釋，RET/PTC以胞漿呈棕黃色為陽性，NF-κB以胞漿/核呈棕黃色為陽性。陰性對照為用PBS代替一抗或用含有小鼠單抗IgG1的神經膠質酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP，Dako)稀釋至與一抗相同IgG1濃度代替單抗。②NF-κB和RET/PTC抗原免疫熒光雙標記及激光共聚焦顯微鏡觀察：免疫組化采用SP法，滴加適當稀釋的第一抗體混合液(NF-κB p65兔多抗1∶50，RET/PTC鼠單抗1∶50)，4℃過夜。37℃復溫1 h，PBS洗滌，5 min × 3次，滴加適當稀釋的第二抗體混合液(Texas Red標記的羊抗兔1∶50；FITC標記的羊抗鼠1∶50)，37℃孵育40 min，PBS洗滌，DAPI襯染細胞核，PBS充分洗滌，無熒光緩沖甘油封片，用Olympus FV1000的激光共聚焦顯微鏡觀察并照相，用于FITC的激發波長為488 nm，用于Texas-Red的激發波長為543 nm，用于DAPI的激發波長為340 nm。兩種免疫組化分別設相應的陽性對照和陰性對照。

4 統計學方法 用SPSS 11.0版統計學軟件，對實驗組及對照組年齡差異采用非配對t檢驗，性別差異及每兩組間實驗結果陽性率差異采用Pearson χ2檢驗或Fisher精確檢驗，用卡方檢驗研究甲狀腺組織中NF-κB與 RET/PTC表達及活化的相關性，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 RET/PTC免疫組化結果 RET/PTC陽性信號主要存在于HT及PTC病變組織甲狀腺濾泡上皮細胞胞漿內(見圖1)。HT、HT合并PTC、PTC疾病性甲狀腺組織中RET/PTC陽性率分別為30%(6/20)、60%(9/15)和65%(13/20)，18例正常甲狀腺組織RET/PTC癌基因蛋白表達均為陰性。統計學分析，RET/PTC在HT、HT合并PTC和PTC中的表達均顯著高于對照組正常甲狀腺組織(均P<0.05)(見表1)，但是，RET/PTC在HT合并PTC和PTC組中的表達無統計學差異(P>0.05)。在HT中的表達與所有PTC病例(包括HT合并PTC組)中的表達有統計學差異(P<0.05)。

圖1 HT患者(A)及PTC患者(B)RET/PTC抗體免疫組化染色結果(SP法×40)

2 NF-κB p65免疫組織化學結果 NF-κB陽性信號主要位于甲狀腺濾泡上皮細胞胞漿和(或)胞核。HT標本中，NF-κB p65陽性信號位于淋巴濾泡間甲狀腺上皮細胞胞漿和胞核內，少數表達于浸潤在甲狀腺組織中的淋巴細胞(見圖2A)。PTC標本中，陽性信號表達于腫瘤細胞胞漿和胞核內(見圖2B)。在對照組正常甲狀腺組織中陽性信號均表達于甲狀腺上皮細胞胞漿，但是大多數正常甲狀腺組織(13/18)上皮表達陰性。HT、HT合并PTC、PTC和正常甲狀腺組織中NF-κB p65 免疫組化陽性率分別為90%(18/20，9例核轉位)、93.3%(14/15，13例出現核轉位)、95%(19/20，16例出現核轉位)和27.8%(5/18，無1例出現核轉位)，它們與RET/PTC蛋白共同表達率分別為30%(6/20)、60%(9/15)、65%(13/20)和0(RET陽性病例全部出現NF-κB 核轉位)。統計學分析，NF-κB p65在HT、HT合并PTC和PTC中的表達均顯著高于正常對照組，而且NF-κB p65的表達和RET/PTC蛋白的表達密切相關(見表1，Pearson χ2檢驗，P<0.01)。與正常甲狀腺組織中NF-κB蛋白表達相比較，發現在疾病性甲狀腺組織中NF-κB表達升高并且在HT、HT合并PTC及PTC病人甲狀腺組織中表達RET蛋白的病例均出現了明確的NF-κB核轉位，即NF-κB活化狀態。

圖2 HT患者(A)及PTC患者(B) NF-κB p65抗體免疫組化染色結果(SP法×40)

組 別RET抗原NF?κBRET/NF?κBHT6/20(30)?18/20(90)?6/20(30)HT合并PTC9/15(60)?14/15(93．3)?9/15(60)PTC13/20(65)?19/20(95)?13/20(65)NTT0/18((0)5/18(27．8)0/18((0)

注：與NTT組比較，*P<0.05

3 免疫熒光雙標記及激光共聚焦顯微鏡結果 在HT和PTC組織標本中，均見紅色的NF-κB陽性信號位于甲狀腺濾泡上皮細胞內(圖3A)，陽性上皮細胞同時表達RET/PTC蛋白綠色著色(圖3B)，激光共聚焦圖象迭合后發現絕大部分細胞共定位于甲狀腺濾泡上皮細胞內(圖3C，黃白色)。

A：NF-κB的表達(紅色熒光)(Texas Red，×600)；B：RET/PTC抗原的表達(綠色熒光)(FITC，×600)；C：激光共聚焦結果，顯示NF-κB和RET/PTC抗原共表達于甲狀腺濾泡上皮細胞胞漿和/或胞核(黃白色，藍色為DAPI襯染細胞核)(激光共聚焦，×600)

圖3 RET/PTC抗原和NF-κB的免疫熒光雙標記及激光共聚焦結果

討 論

在本研究中，我們通過免疫組化及免疫熒光雙標記激光共聚焦兩種方法在人體甲狀腺組織中發現HT及PTC中RET/PTC和NF-κB高表達，共表達、共定位。利用免疫組化方法，我們發現HT及PTC患者甲狀腺組織中RET/PTC癌基因表達率明顯高于對照組，并發現NF-κB p65在HT、HT合并PTC和PTC中的表達均顯著高于正常對照組，而且NF-κB p65的表達和RET/PTC蛋白的表達密切相關，進一步通過免疫熒光雙標記法和激光共聚焦顯微鏡檢測觀察發現NF-κB與RET/PTC抗原共表達于HT及PTC甲狀腺濾泡上皮細胞內。因此，我們認為核轉錄因子NF-κB p65可能通過RET/PTC活化在橋本甲狀腺炎癌變中發揮重要的作用。

核轉錄因子NF-κB是Rel蛋白家族成員，是廣泛存在于真核細胞漿中的核轉錄因子，在各種細胞因子相互影響和相互作用的復雜網絡中，NF-κB作為轉錄因子，起著中心調控作用[6]。靜息時NF-κB通常以同源或異源二聚體p65和p50的形式與抑制蛋白IκB結合成無活性的復合物滯留于胞漿中。多種因素可激活NF-κB，如細胞因子、絲裂原、環境變化、病毒或細菌產物等。當細胞受到活化刺激后，NF-κB與其抑制蛋白IκB解離，然后自胞漿進入胞核與其靶基因的啟動子或增強子的κB位點結合，調控靶基因的表達。NF-κB一方面可調控與炎癥和免疫反應有關的許多炎癥介質基因的表達[9]，在炎癥反應的復雜調控網絡中起著中心調控的作用；另一方面它還可調節細胞增殖基因及抗凋亡基因的表達，從而在腫瘤的發生中具有重要作用[7-8]。近年來的研究發現，NF-κB p65 過表達在甲狀腺上皮細胞的惡性轉化過程中起著很重要的作用[9]。

RET/PTC癌基因被認為是PTC發生的特征性基因[4]，但是近年來在HT非癌性甲狀腺濾泡上皮細胞中該基因的檢出率也非常高，甚至達到90%以上[8]，提示共同的分子機制可能存在于PTC發展的早期階段。細胞培養和動物實驗研究表明RET/PTC癌基因產物可以誘導NF-κB的活化[8-9]。活化的NF-κB一方面能夠進一步誘導正常上皮細胞發生惡性轉化，另一方面，它可以促進許多致炎細胞因子如單核細胞趨化蛋白MCP1、白介素-6(IL-6)等的轉錄，引起腫瘤發生部位炎細胞浸潤，細胞免疫失衡，介導炎癥相關性腫瘤的形成。在HT中，是否RET/PTC的出現是導致腫瘤發生的早期因素，這一基因的蛋白表達是否通過誘導NF-κB的活化進一步誘導甲狀腺上皮細胞癌變，導致PTC的發生？目前，國內外這方面的研究及對這一致癌途徑的推測都是基于動物實驗或者細胞培養水平所得，人體內NF-κB活化與腫瘤發生、發展和轉移的關系還很不清楚。本研究中我們通過免疫組化技術 發現RET/PTC癌基因蛋白表達主要存在于甲狀腺乳頭狀癌組織中，也存在于非癌性HT病人的甲狀腺組織中，而正常組織中RET/PTC癌基因代表表達全部陰性。這一結果說明PTC病人中大部分發生RET/PTC重排，正常甲狀腺組織無此癌基因重排，而HT病人中也存在相當多的RET/PTC重排病患。出現RET/PTC癌基因重排是HT與PTC共同早期病變，這一結果為RET/PTC癌基因產物可能誘導NF-κB活化，導致HT癌變為PTC提供了理論基礎。通過統計分析，我們進一步發現NF-κB p65表達和RET/PTC蛋白的表達密切相關，RET/PTC抗原陽性的病例均出現了NF-κB核轉位，即NF-κB活化狀態，這一結果支持RET/PTC具有對NF-κB的活化作用。應用免疫熒光劑激光共聚焦檢測，我們發現NF-κB與RET/PTC抗原共表達于HT及PTC甲狀腺濾泡上皮細胞內，這一結果進一步提示RET/PTC能夠活化NF-κB，從而在橋本甲狀腺炎癌變中發揮重要的作用。我們的研究結果不但有助于更進一步地研究PTC的發病機制，而且對臨床上治療及預防PTC提供了新的思路。

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*國家自然科學基金資助項目(81372857)

陜西省科學技術研究發展計劃項目(2008K09-09)

西安市科技計劃項目[SF09027(9)]

甲狀腺炎 甲狀腺腫瘤 NF-κB 基因表達調控，腫瘤 @RET/PTC

R736.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.002

(收稿：2017-02-24)