法舒地爾對HL-60細胞增殖、凋亡、分化及侵襲作用的影響*

賈少勛，茹杏麗，王 一

陜西省人民醫院血液內科(西安710068)

△通訊作者

法舒地爾對HL-60細胞增殖、凋亡、分化及侵襲作用的影響*

賈少勛，茹杏麗，王 一△

陜西省人民醫院血液內科(西安710068)

目的： 探討ROCK酶抑制劑法舒地爾對HL-60細胞增殖、凋亡、分化以及侵襲作用的影響。方法： 用臺盼藍拒染實驗繪制法舒地爾作用下，HL-60細胞的生長曲線；MTT法檢測法舒地爾對HL-60細胞增殖抑制。應用流式細胞術CD11b抗原表達，硝基四唑氮藍(NBT)還原實驗分析法舒地爾對HL-60細胞分化影響。采用AnnexinV/PI雙染試劑盒上流式細胞儀測定細胞凋亡。利用Transwell穿孔板法觀察法舒地爾對HL-60細胞侵襲力的影響。結果： 法舒地爾抑制HL-60細胞呈濃度和時間依賴性、法舒地爾作用于HL-60細胞12、24、48、72 h的半數抑制濃度(IC50)分別為(89.65±12.45)μmol/L、(69.21±15.48) μmol/L、(65.29±20.31) μmol/L以及(58.54±10.02)μmol/L。法舒地爾誘導HL-60細胞凋亡呈時間和劑量依賴性。法舒地爾可增加HL-60細胞后硝基四唑氮藍陽性率，上調CD11b單核分化抗原的表達。法舒地爾明顯抑制HL-60細胞穿透Transwell小室，侵襲到穿孔膜外。結論：法舒地爾有抑制HL-60細胞增殖、誘導凋亡、促進分化及抑制侵襲等多種抗白血病作用。

法舒地爾是一種ROCK激酶抑制劑，主要作用抑制細胞內ROCK活性，從而抑制血管收縮，臨床的主要適應證為蛛網膜下腔出血所致血管痙攣，而ROCK激酶在多種腫瘤細胞中高表達，且影響預后[1-2]。已有的研究提示法舒地爾可誘導腫瘤細胞凋亡、阻滯細胞侵襲[3-4]。本研究擬觀察法舒地爾對白血病HL-60細胞增殖、分化和凋亡的影響，以期將法舒地爾作為抗白血病藥物提供實驗室依據。

材料和方法

1 主要實驗材料 人髓系白血病細胞系HL-60(中國醫學科學院血液病研究所王敏教授惠贈)；法舒地爾購于天津紅日藥業；細胞培養液RP1640及胎牛血清購于美國Gibco公司；小鼠抗人CD11b-PE單抗及IgG-PE對照抗體、凋亡檢測試劑盒、Tanswell穿孔板及Annexin V-FADD 凋亡檢測試劑盒均為美國B-D公司產品；四唑氮蘭(NBT)、佛波醇(TPA)及于噻唑藍(MTT)均購于美國Sigma公司。

2 法舒地爾對HL-60細胞增殖活性檢測 ①錐蟲藍染色活細胞計數：調整HL-60細胞密度為2×105/ml,分別接種于含不同濃度法舒地爾(分別為0、25、50、75、100 μmol/L)培養液中,每瓶含5 ml。培養24、48、72 h,吸取10 μl 0.4%臺盼藍置于EP管中,再吸取90 μl待染色的細胞懸液,混勻靜置約3 min后用計數板計數活細胞數。每次每瓶計數3次,實驗重復3次,繪制細胞增殖抑制曲線。②MTT法檢測法舒地爾對HL-60細胞的半數抑制濃度(IC50)：調整HL-60細胞密度為5×104接種于96孔無菌培養板中，每孔200 μl。實驗組和空白組的設置同方法①。每組每個濃度下設3個復孔，實驗重復3次。培養24、48、72 h后加10 μl MTT(10 mg/L)，繼續培養4 h后離心棄上清液，每孔加入150 μl DMSO終止反應，微振蕩后，用全自動酶標儀在570 nm波長處讀取吸光度值，計算抑制率并繪制劑量效應曲線，求出法舒地爾對HL-60增殖抑制率、求出細胞的半數抑制濃度(IC50)

3 四唑氮蘭(NBT)還原實驗 將細胞以1×105ml的密度接種于4個25 cm2培養瓶中，每瓶加細胞懸液5 ml,其中一瓶為對照，其余3瓶分別加入法舒地爾使其細胞懸液中的終濃度分別為0、25、75、100 μmol/L作用96 h后,離心收集細胞,加入終濃度為1.0 mg/ml的NBT和20 ng/ml的佛波醇(TPA),再在培養箱中37℃孵育30 min，甩片機將細胞均勻涂片,光鏡下觀察并計數200個細胞,細胞被染成藍紫色的為陽性細胞，計算陽性細胞百分比，實驗重復3次。

4 流式細胞儀檢測細胞膜上CD11b 流式細胞術檢測細胞表面分化抗原：取對數生長期細胞接種于6孔板，HL-60細胞細胞密度為2×105/ml，經25、50、75 μmol/L濃度處理72 h，用1×PBS洗滌2次，再各加入5 μl小鼠抗人CDllb-PE，并以小鼠抗人IgG-PE單克隆抗體為質控對照，室溫避光孵育15 min，上流式細胞儀進行檢測，實驗重復3次，結果取平均值。

5 細胞凋亡率檢測 處于對數生長期的HL-60細胞以2×105/ml濃度每孔5 ml培養于6孔板中，將法舒地爾按照0、25、50、75 μmol/L處理6、12、24、48 h，細胞收集離心后用PBS重懸洗滌2次；按照試劑盒

說明，加入10 μl Annexin V的混合物、5 μl FADD,混勻，室溫避光反應15 min，上流式細胞儀后檢測細胞凋亡率，實驗重復3次，結果取平均值。

6 細胞侵襲能力檢測 按照產品說明,將直徑為8 μm Transwell小室放入24孔培養板中，構建體外的白血病細胞的遷移模型。Transwell小室上室中加入不含血清的RPMI1640重懸，含HL-60細胞濃度為1.0×107/ml的無血清的RPMI1640細胞液100 μl,下室中加入含12%血清的RPMI1640培養液600 μl；上室中分別加入法舒地爾濃度為0、50、100 μmol/L,12 h后計數下室的細胞數，實驗重復3次，取平均數。

7 統計學方法 結果通過SPSS 11.5統計學軟件分析。均值間比較使用￡檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1 法舒地爾對HL-60細胞生長曲線的影響 見圖1。不同濃度法舒地爾(0、25、50、75 μmol/L)作用于HL-60細胞24、48、72、96 h均能明顯抑制其增殖，隨著藥物濃度的增大抑制效果逐漸增強，法舒地爾抑制HL-60細胞增殖呈濃度和時間依賴性。

圖1 法舒地爾對HL-60 細胞的增殖抑制作用

2 法舒地爾對HL-60 細胞IC50的影響 12、24、48、72 h的IC50值分別為(89.65±12.45)μmol/L、(69.21±15.48) μmol/L、(65.29±20.31) μmol/L及(58.54±10.02)μmol/L，法舒地爾對HL-60細胞的IC50值隨時間的延長出現明顯降低。

3 法舒地爾對HL-60細胞凋亡的影響 見表1。25、50、75 μmol/L濃度的法舒地爾作用于HL-60細胞6、12、24、48 h均可檢測到細胞的明顯凋亡，且凋亡呈現明顯時間和劑量依賴性結果。

表1 法舒地爾對HL-60細胞凋亡率的影響

注：對照組為0 μmol/L,各實驗組與對照組相比，*P<0.05

4 法舒地爾對HL-60細胞分化的影響 法舒地爾對HL-60細胞 NBT還原能力的影響：濃度為25、50、75 μmol/L的法舒地爾處理HL-60細胞72 h可見藍染細胞百分率(NBT陽性率)為分別為(13.20±3.85)%、(22.7±6.18)%以及(24.84±2.36)% 均顯著高于對照組(7.58 ±1.62)%(P<0.05)。法舒地爾對HL-60細胞單核分化抗原CD11b表達的影響：用法舒地爾以25、50、75 μmol/L濃度處理HL-60細胞72 h后CD11b陽性率分別為(17.20±1.31)%,(24.46±2.61)%及(45.43±1.58)%均顯著高于對照組(7.17±1.04)% (P<0.05)。

5 法舒地爾對HL-60細胞遷移的影響 用法舒地爾分別以25、50、75 μmol/l濃度處理Transwell小室上室HL-60細胞24 h后結果遷移到下室細胞數隨著藥物濃度的增大逐漸減少，分別為(4.56±1.08)×105/孔、(3.21±0.29)×105/孔以及(2.59±0.11)×105/孔，對照組下室細胞數為(5.35±0.54)×105/孔，對照組與實驗組各組間相比差異具有統計學意義(P<0.05)。

討 論

本研究觀察了法舒地爾對白血病HL-60細胞的增殖、分化、凋亡以及侵襲力的影響。研究結果發現50～100 μmol/L濃度的法舒地爾對HL-60細胞具有明顯抑制增殖且呈時間和劑量依賴性，低于此濃度的法舒地爾可有效誘導HL-60細胞凋亡。細胞分化阻滯在白血病的發生中起重要作用，因此誘導細胞分化是白血病治療重要機制之一，本研究發現法舒地爾作用72 h后，HL-60細胞對NBT還原能力明顯增強，同時使明顯上調HL-60細胞單核細胞分化抗原CD11b。ROCK活性增強，可使細胞骨架發生變化，從而導致腫瘤遷徙和浸潤。有研究結果表明法舒地爾可以有效抑制包括膀胱癌、膠質瘤等腫瘤浸潤和侵蝕。通過Tanswell小室模仿白血病浸潤模型的建立，本研究結果發現法舒地爾可顯著減少HL-60細胞的侵襲。

法舒地爾有減少血管痙攣，而在臨床上主要用于蛛網膜下腔出血導致的血管痙攣以及缺血性腦病，有研究結果表明法舒地爾可以有效保護心臟免受蒽環類藥物的損害[8]。在急性白血病的化療中多采用的方案為蒽環類藥物聯合阿糖胞苷[9]。本研究結果提示法舒地爾可以通過抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡、促進分化以及減少侵襲等多種作用產生明顯抗白血病作用。如果將法舒地爾與蒽環類化療藥物聯合用于急性白血病的治療中，有可能在提高白血病療效的同時，可能明顯減少化療藥物對心臟功能的損害。

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Effectsoffasudilonproliferation,apoptosis,differentiationandcellmigrationofHL-60cell

Jia Shaoxun,Ru Xinglin,Wang Yi.

Department of Hematology, Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an 710068)

Objective：To investigate the effect of Rho kinase inhibitor fasudil on proliferation，differentiation ,apoptosis and migration of HL-60 cells. Methods：Cell growth curve was analyzed by trypan blue staining, and the inhibitory effect of fasudil on the proliferation of HL-60 cells MTT assay. The differentiation of HL-60 cells exposed to different concentrations of fasudil was evaluated by expression of CD11b using flow cytometry and NBT reduction test. Cell apoptosis rate detected with AnnexinV/FADD double staining by flow cytometry. Trans well chamber in vitro tumor cell migration model was observed the effects of fasudil on leukemic cell migration. Results ：Fasudil inhibited growth of HL-60 cellsin a time-and dose -dependent manner .When HL-60cells was treated by fasudil at 12h, 24h,48h and 72h , the median inhibitory concentration(IC50)were(89.65±12.45)μmol/L,(69.21±15.48) μmol/L,(65.29±20.31) μmol/L and(58.54±10.02) μmol/L, respectively. Fasudil induced apoptosis of HL-60 cells in time-and-dose effect.Fasudil could upregulate the expression of CD11b of HL-60 cells and increased position of NBT in HL-60 cells .Fasudil reduced Significantly fewer HL-60 cells were migrated into the lower compartment. Conclusion: Fasudil can inhibit the proliferation of leukemic cells and induce HL-60 cells apoptosis, promote the differentiation of leukemia cells, can inhibit leukemic cells distant metastasis.

HL-60 cells Cell proliferation Apoptosis Cell differentiation @Fasudil

*陜西省自然科學基金資助項目(2012JM4050)

HL-60細胞 細胞增殖 細胞凋亡 細胞分化 @法舒地爾

R733

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.003

(收稿：2017-01-20)