芹菜素誘導人乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的實驗研究*

孫曉力，翟宏軍△，張心武，馬小斌，馬雙余

1.西安交通大學第二附屬醫院普外科(西安710004)，2.西安交通大學第二附屬醫院腫瘤科(西安710004)

△通訊作者

芹菜素誘導人乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的實驗研究*

孫曉力1，翟宏軍1△，張心武1，馬小斌2，馬雙余1

1.西安交通大學第二附屬醫院普外科(西安710004)，2.西安交通大學第二附屬醫院腫瘤科(西安710004)

目的：探討芹菜素對人乳腺癌MDA-MB-231細胞的凋亡作用及相關機制。方法：常規培養人乳腺癌MDA-MB-231細胞，取對數期生長細胞分為芹菜素40、80、160 μmol/L組和空白對照組，分別用芹菜素40、80、160 μmol/L和生理鹽水進行處理。處理24、48 h后，采用MTT法檢測各組細胞的增殖情況，流式細胞儀檢測處理48 h后凋亡和細胞周期情況，Western blot方法檢測處理48 h后，Pro-Caspase-3、Caspase-3和Caspase-6蛋白的表達情況。結果：MTT和流式結果顯示，芹菜素80、160 μmol/L 處理組在24、48 h均可顯著抑制MDA-MB-231細胞的生長，且160 μmol/L 處理組比80 μmol/L處理組的抑制作用更強。40 μmol/L處理組在24 h顯示對MDA-MB-231細胞的生長有一定作用，但與對照組相比無統計學差異。Western blot結果顯示，芹菜素40、80、160 μmol/L組和空白對照組處理細胞48 h后，Caspase-3和Caspase-6蛋白表達水平隨著芹菜素濃度的增高而依次上調，同時Pro-Caspase-3蛋白表達逐次降低。結論：芹菜素對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖有抑制作用，并能誘導細胞的凋亡，其作用機制可能與Caspase-3、6信號通路的激活有關。

芹菜素廣泛存在于水果和蔬菜中，并且具有抗炎、抗腫瘤以及自由基清除等作用[1-3]。研究結果顯示，芹菜素可通過促進細胞周期停滯和凋亡作用來抑制細胞的生長[3-4]。本研究利用人乳腺癌MDA-MB-231細胞探討芹菜素的體外抗腫瘤作用及其作用機制。

材料與方法

1 材料與試劑 人乳腺癌MDA-MB-231細胞株(美國細胞庫，ATCC)；胎牛血清(FBS；Gibco，美國)；RPMI-1640培養基(Hyclone，美國)；青霉素、鏈霉素(Solarbio，中國)；MTT(Sigma，美國)；BCA蛋白定量試劑盒(Pierce，美國)；Bio-Rad protein assay和預染蛋白質分子量標準(Bio-Rad，美國)；Annexin V-FITC/PI雙染檢測凋亡試劑盒(Beckman Coulter，美國)；碘化丙啶(PI；Sigma，美國)。

2 實驗方法 ①實驗分組：將人乳腺癌MDA-MB-231細胞培養于含1%青鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，5% CO2、37 ℃培養箱中常規培養，細胞處于對數生長期時將細胞分為芹菜素40、80、160 μmol/L組和空白對照組，按照分組條件分別用芹菜素40、80、160 μmol/L和生理鹽水處理。②MTT法檢測細胞增殖：取對數生長期MDA-MB-231細胞，以5×104個/孔的密度接種于96孔板中，待細胞完全貼壁后，按照分組條件分別加入芹菜素40、80、160 μmol/L和生理鹽水，其中每組設置5個復孔。于37 ℃培養箱培養24、48 h后，各組細胞分別加入5 mg/ml MTT 20 μl/孔，37℃培養箱培養4 h吸去上清液，每孔加150 μl 二甲基亞砜，搖床震蕩溶解紫色結晶，酶標儀波長490 nm 處測定吸光度(A)值，檢測各組細胞的增殖情況并繪圖。③流式細胞儀檢測細胞周期及細胞凋亡：取對數生長期MDA-MB-231細胞，以2×105個/ml密度接種于6孔板中，孵育過夜后，按照分組條件處理細胞，48 h后每組收集1×105個細胞，PBS清洗后離心沉淀，70%乙醇溶液重懸并固定過夜，細胞經PBS清洗1次后離心收集，加入500 μl含50 μg/ ml PI、100 μg/ml RNase A、0.2% Triton X-100 的預冷PBS，避光放置30 min，流式細胞儀檢測細胞周期；同樣方法收集洗滌細胞，加入10 μl AnnexinV- FITC，冰上避光孵育15 min，離心去除上清，并用預冷緩沖液重懸，加入10 μl PI，混勻后樣本置于冰上避光15 min，PBS清洗，1 ml PBS重懸后流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。④Western blot檢測相關蛋白的表達：根據分組條件，收集處理完成的MDA-MB-231細胞，細胞裂解液冰上裂解。BCA試劑盒對蛋白濃度定量，按Bio-Rad說明書以總蛋白量20 μg/孔進行SDS-PAGE電泳。電泳后，凝膠上的蛋白轉至PVDF膜。加入Pro-Caspase-3、β-actin、Caspase-3和Caspase-6小鼠單克隆抗體，二抗為山羊抗小鼠IgG-HRP，電化學發光顯影，Alpha凝膠成像系統拍照。

3 統計學方法 采用 SPSS 19.0 統計學軟件對數據行統計學分析，ANOVA重復測量方差分析法對各實驗組和對照組間細胞生長水平差異比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 不同濃度芹菜素處理24、48 h對MDA-MB-231細胞增殖的影響 見圖1。芹菜素80、160 μmol/L 處理組在24、48 h均可顯著抑制MDA-MB-231細胞的生長，且160 μmol/L 處理組比80 μmol/L處理組的抑制作用更強。40 μmol/L處理組在24 h顯示對MDA-MB-231細胞的生長有一定作用，但與對照組相比無統計學差異。芹菜素相同作用濃度下，處理時間越長則細胞生長抑制作用越強。

與空白對照組相比，**P<0.01，*** P< 0.001

2 不同濃度芹菜素處理對MDA-MB-231細胞凋亡的影響 見圖2。不同濃度芹菜素處理細胞48 h后能夠促細胞凋亡。和生理鹽水處理組相比，80、160 μmol/L芹菜素處理48 h后可顯著促進MDA-MB-231細胞凋亡，且凋亡率160 μmol/L處理組比80 μmol/L處理組更高。40 μmol/L處理組對MDA-MB-231細胞有一定的促凋亡作用，但與生理鹽水組相比無統計學差異。芹菜素對細胞凋亡的作用依賴于藥物濃度。

A：對照組；B:芹菜素40 μmol/L處理組；

3 不同濃度芹菜素處理對MDA-MB-231細胞周期的影響 見圖3。對照組細胞大部分位于G0/G1期，80、160 μmol/L組在處理48 h后，細胞更多停留在G2/M期，40 μmol/L處理組雖然細胞進入G2/M期有一定促進作用，但與對照組相比無統計學差異。

4 不同濃度芹菜素處理對MDA-MB-231細胞Pro-Caspase-3、Caspase-3、Caspase-6蛋白表達的影響見圖4。隨著芹菜素濃度的增高，Caspase-3和Caspase-6蛋白表達水平依次上調，同時Pro-Caspase-3蛋白表達逐次降低。說明芹菜素可通過上調Caspase-3和 Caspase-6的表達水平，促進MDA-MB-231細胞的凋亡。

A：對照組；B:芹菜素40 μmol/L處理組；

圖4 芹菜素處理MDA-MB-231細胞48 h后對Pro-Caspase-3、Caspase-3、Caspase-6蛋白表達的影響

討 論

芹菜素(apigenin，C15H10O5)又被稱為4，5，7-三羥基黃酮，是一種可從傘形科植物旱芹中分離提取的天然黃酮類化合物[5]，同時也廣泛存在于水果、蔬菜、豆類以及植物源性的飲品中，因此被認為是黃酮的主要來源之一。本研究主要利用芹菜素對人乳腺細胞株MDA-MB-231進行干預，初步探討芹菜素對乳腺癌細胞的增殖、凋亡以及細胞周期的影響。結果顯示，芹菜素對人乳腺癌MDA-MB-231細胞具有顯著的抑制增殖和細胞周期的作用，并能明顯促進MDA-MB-231細胞的凋亡，且作用依賴于時效和量效性。在此實驗結果基礎上，我們進一步檢測了Caspase通路相關蛋白Pro-Caspase-3、Caspase-3和Caspase-6的表達情況，結果顯示，芹菜素可顯著上調Caspase-3和Caspase-6蛋白表達水平，同時下調Pro-Caspase-3蛋白表達水平，該作用具有一定量效性。這說明芹菜素可能通過Caspase途徑上調Caspase-3和 Caspase-6的表達水平，誘導細胞凋亡，從而對人乳腺癌MDA-MB-231細胞產生抗腫瘤作用。

細胞凋亡是細胞發生程序性死亡的一系列有序的過程，在哺乳動物細胞中有兩種核心途徑可誘導凋亡的產生，外在的死亡受體途徑以及內在的線粒體途徑[6]。其中，內在途徑與線粒體膜電位變化(ΔΨm)和線粒體通透性轉變有關[7]。當細胞收到來自細胞內和細胞外的信號刺激時，線粒體外膜的滲透性發生改變，細胞色素C釋放至胞質中，而釋放的細胞色素C則可形成凋亡小體(一種由細胞色素C和凋亡蛋白酶激活因子1組成的蛋白復合物)激活Caspase通路，最終導致Caspase-9和隨后的Caspase-3的活化，細胞發生不可逆的凋亡。Caspase蛋白家族是一類存在于細胞質當中的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，目前已發現14個成員，可分為三類：凋亡效應分子、凋亡啟動分子以及促炎分子類。無論外在的死亡受體途徑還是內在的線粒體途徑，均需經過Caspase蛋白的活化和處理。其中，Caspase-3和Caspase -6屬于凋亡效應分子，位于凋亡級聯反應的下游，可直接使細胞發生凋亡。在本研究中，我們發現經芹菜素處理后的人乳腺癌MDA-MB-231細胞Caspase-3蛋白水平的顯著上調，酶原形式的Pro-Caspase-3表達下降，因此可推斷芹菜素能誘發Caspase-3的活化。在Caspase-3蛋白活化的同時，凋亡效應蛋白Caspase-6在芹菜素處理后也出現表達的上調。該結果提示芹菜素可直接或者間接誘發Caspase信號通路中效應蛋白Caspase-3和Caspase -6，對人乳腺癌MDA-MB-231細胞產生促凋亡的作用。

綜上，芹菜素能抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖并誘導細胞的凋亡，其作用機制可能與芹菜素引起Caspase信號通路中Caspase-3、6蛋白表達增加有關。其具體的分子機制還需要未來做出更深入的臨床前藥理學研究，但是本研究仍為芹菜素應用于臨床抗乳腺癌治療提供了應用前的理論依據。

[1] Tran HNK，Nguyen VT，Kim JA，etal. Anti-inflammatory activities of compounds from twigs of Morus alba [J]. Fitoterapia，2017，120:17-24.

[2] Sung B，Chung HY，Kim ND. Role of Apigenin in Cancer Prevention via the Induction of Apoptosis and Autophagy [J]. J Cancer Prev，2016，21(4):216-226.

[3] Guzel A，Aksit H，Elmastas M，etal. Bioassay-guided isolation and identification of antioxidant flavonoids from Cyclotrichium origanifolium (Labill.) Manden and Scheng [J].Pharmacogn Mag，2017，13(50)：316-320.

[4] 歷 強，馬建倉，趙 軍. 芹菜素抑制腫瘤作用的研究進展[J].陜西醫學雜志，2003，32(5)：439-441，460.

[5] Shukla S，Gupta S. Apigenin: a promising molecule for cancer prevention[J].Pharm Res，2010，27 (6)：962-978.

[6] Hanahan D，Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation[J].Cell，2011，144：646-674.

[7] Ouyang L，Shi Z，Zhao S，etal. Programmed cell death pathways in cancer: areview of apoptosis，autophagy and programmed necrosis[J].Cell Prolif，2012，45：487-498.

StudyonapigenininducedapoptosisofhumanbreastcancercelllineMDA-MB-231

Sun Xiaoli，Zhai Hongjun，Zhang Xinwu，et al.

Department of General Surgery， The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710004 )

Objective: To study the apigenin induced apoptosis of human breast cancer cell line MDA-MB-231 and its mechanism. Methods: Conventional culture human breast cancer cell line MDA-MB-231. The cells in logarithmic phase were divided into 40，80，160 μmol/L apigenin group and control group，and treated with 40，80，160 μmol/L apigenin and saline respectively. After 24 and 48 h treatment，cell proliferation was measured using the MTT assay to detect every group. Flow cytometry was used to detect the rate of apoptotic and cell cycle for MDA-MB-231 cells after treated with 40，80，160 μmol/L apigenin and saline for 48 h. The protein expression of Pro-Caspase-3，Caspase-3 and Caspase-6 were detected by Western blot in every group after 48 h treatment. Results: MTT and flow cytometry assay showed that both 80，160 μmol/L apigenin treated group significantly inhibit the proliferation of MDA-MB-231 cells after 24，48 h，and the inhibition of 160 μmol/L treated group was stronger than 80 μM treated group. 50 μmol/L apigenin treated group had an inhibitive effect compared with the control group，but there was no significant difference. Western blot revealed that the expressions of Caspase-3 and Caspase-6 were up-regulated with the increased of apigenin concentration，as well as the expression of Pro-Caspase-3 was decreased. Conclusion: Apigenin exhibits an inhibitory effect of the proliferation and promote apoptosis of MDA-MB-231 cells.The mechanism may be associated with the activation of Caspase-3，6 signaling pathway.

Breast neoplasms Cell proliferation Apoptosis @Apigenin

*陜西省自然科學基礎研究計劃項目(2015JM8430)

乳腺腫瘤 細胞增殖 細胞凋亡 @芹菜素

R737.9

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.005

(收稿：2017-03-22)