miR-425調控PDL-1通路調節腎上皮細胞增殖、凋亡作用的實驗研究*

蔣小麗，周慧芳，毛能建

新疆維吾爾自治區喀什地區第一人民醫院檢驗科(喀什844000)

miR-425調控PDL-1通路調節腎上皮細胞增殖、凋亡作用的實驗研究*

蔣小麗，周慧芳，毛能建

新疆維吾爾自治區喀什地區第一人民醫院檢驗科(喀什844000)

目的：探討miR-425通過調控PDL-1通路調節腎上皮細胞的增殖及凋亡作用。方法：腎上皮細胞HRCEpiC分別轉染miR-425模擬物及對照模擬物，采用qRT-PCR方法檢測miR-425表達水平，采用MTT法與Tunel試驗測定細胞增殖及凋亡作用，采用Western blot實驗測定PDL-1表達水平。結果： qRT-PCR結果顯示轉染后實驗組miR-425的表達水平較空白組、陰性對照組升高約37.82倍。轉染48 h后實驗組、陰性對照組與空白組的活細胞比例分別為(75.22±3.19)%、(98.29±2.11)%和(100±0.00)%，細胞凋亡率分別為(17.20±2.49)%、(4.29±1.44)%和(0.52±0.11)%，組間對比差異有統計學意義(P<0.05)；轉染48 h后Western blot檢測顯示實驗組的PDL-1表達水平都明顯低于陰性對照組與空白組(P<0.05)。結論：miR-425可通過激活PDL-1通路，降低腎上皮細胞增殖能力，提高其凋亡能力，從而介導腎上皮細胞的生物學行為。

材料與方法

1 材 料 腎上皮細胞HRCEpiC源于中國醫學科學院細胞中心，選擇RPMI1640+10%血清進行培養(5%CO2、37℃孵箱)；miR-425模擬物及對照模擬物購自Ambion 公司；免疫印跡化學發光(ECL)系統購自美國Syngene公司；兔抗人β-actin單克隆抗體購自Abcam公司，兔抗人PDL-1單克隆抗體及相應二抗及熒光二抗均購自Santa Cruz公司；脂質體Lipo-fectamine2000購自Invitrogen公司；MTT檢測試劑盒購自美國Sigma 公司。

2 實驗方法 ①細胞增殖實驗：選擇HRCEpiC細胞中通過脂質體轉染試劑瞬時轉染miR-425模擬物及對照模擬物，并通過Real time PCR分別驗證轉染效率。將轉染后的細胞株分別以5000個/孔的密度接種于96空培養板中，培養48 h后，應用MTT試劑盒測定細胞增殖性，各實驗均重復接種于3個孔中。②細胞凋亡實驗：采用原位細胞凋亡檢測技術(Tunel試驗)，HRCEpiC細胞在96孔培養48 h后取1 ml細胞，1000 r/min，4 ℃離心10 min，取沉淀，PBS重懸細胞，離心后取呈現，加入300 μl凋亡檢測緩沖液，以每個象限的細胞數目是檢測細胞總數所在點的百分比計算凋亡率，各實驗均重復接種于3個孔中。③Western blot實驗：在miR-425瞬時轉染分別在48 h 后提取細胞總蛋白，并用BCA法測定蛋白濃度。各組取等量濃度的蛋白樣本，進行SDS-PAGE 凝膠電泳，然后將蛋白轉移至PVDF 膜上，封閉后加入一抗PDL-1，4 ℃過夜。TBST洗膜30 min，加入二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜30 min，加入ECL發光劑，進行電腦掃描發光。

結 果

1 轉染效果 腎上皮細胞HRCEpiC分別轉染miR-425模擬物為實驗組，轉染對照模擬物為陰性對照組，轉染組為空白組。qRT-PCR結果顯示轉染后實驗組miR-425的表達水平較空白組、陰性對照組升高約37.82倍，見表1。

表1 miR-425轉染后的ct值對比

2 細胞增殖情況對比 轉染48 h后實驗組、陰性對照組與空白組的活細胞比例分別為(75.22±3.19)%、(98.29±2.11)%和(100±0.00)%，組間對比差異有統計學意義(P<0.05)。

3 細胞凋亡情況對比 轉染48 h后實驗組、陰性對照組與空白組的細胞凋亡率分別為(17.20±2.49)%、(4.29±1.44)%和(0.52±0.11)%，組間對比差異有統計學意義(P<0.05)。

4 PDL-1表達對比 轉染48 h后Western blot檢測顯示，實驗組的PDL-1表達水平(0.51±0.01)明顯低于陰性對照組(0.65±0.04)與空白組(0.69±0.06)(P<0.05)。

討 論

腎上皮細胞的作用是多方面的，首先上皮細胞通過不斷的增殖，對損傷的腎組織進行修復，維持上皮細胞屏障結構的完整性[4]。另外上皮細胞的效應進一步擴展為潛在的直接免疫調節作用，且這種作用與炎癥刺激時間之間具有一定的相關性[5]。比如HRCEpiC能產生IL-8或直接趨化白細胞參與急性炎癥反應，可參與腎免疫損傷的發生[6]。

MicroRNA是一類21-23 nt的非編碼小分子RNA，它們通過與靶mRNA的編碼區、3'-UTR完全或部分配對，降解靶mRNA或抑制其蛋白質翻譯，在轉錄后水平負調控靶基因的表達[7]。miR-425家族在上皮細胞的形成過程中發揮重要作用，抑制上皮細胞形成過程，促進E-鈣黏蛋白表達[8]。本研究顯示轉染后實驗組、陰性對照組與空白組的活細胞比例分別為(75.22±3.19)%、(98.29±2.11)%和(100±0.00)%，組間對比差異有統計學意義(P<0.05)；轉染48 h后實驗組、陰性對照組與空白組的細胞凋亡率分別為(17.20±2.49)%、(4.29±1.44)%和(0.52±0.11)%，組間對比差異有統計學意義(P<0.05)，表明miR-425表達與腎組織細胞增殖能力呈負相關，與凋亡能力成正相關，miR-425可能參與腎上皮細胞的調控。

PD1最有兩個配體，分別是PDL-1(B7-H1)和PDL-2(B7-DC)，PDL-1蛋白廣泛表達于抗原提呈細(APCs)、活化T、B細胞等。PDL-1與受體結合后可誘導內皮細胞生長、增殖，促進內皮細胞遷移[9]。本研究轉染48 h后Western blot檢測顯示，實驗組的PDL-1表達水平都明顯低于陰性對照組與空白組(P<0.05)，表明miR-425可能參與PDL-1信號轉導通路，從而參與調控腎組織的增殖與凋亡。

總之，miR-425可通過激活PDL-1通路，降低腎上皮細胞增殖能力，提高其凋亡能力，從而介導腎上皮細胞的生物學行為。

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miR-425regulatestheproliferationandapoptosisofrenalepithelialcellbyregulatingPDL-1pathway

Jiang Xiaoli，Zhou Huifang，Mao Nengjian.

Department of Laboratory，The First People’s Hospital of Kashgar Region，Kesha Xinjiang(Kashgar 844000)

Objective: To investigate the effects of miR-425 regulates the proliferation and apoptosis of renal epithelial cell by regulating PDL-1 pathway.Methods: Nasal polyp epithelial cells HRCEpiC were transfected miR-425 mimic and control，qRT-PCR method was used to detect the expression level of miR-425，MTT method and Tunel test were used to detect the cell proliferation and apoptosis，the level of PDL-1 expression were determined by Western blot experiment. Results：The results of qRT-PCR showed that the expression level of miR-425 in the experimental group was about 37.82 times higher than that in the blank group and the negative control group. After transfection of 48h，the proportion of live cells in the experimental group，negative control group and blank group were (75.22±3.19)%，(98.29±2.11)% and (100±0.00)%，the apoptosis rate were(17.20±2.49)%，(4.29±1.44)% and (0.52±0.11)%，there were statistically significant difference compared among the groups (P<0.05); Western blot assay showed that transfection after 48 h，the expression level of PDL-1 in the experimental group were significantly lower than the negative control group and blank control group (P<0.05).Conclusion: miR-425 can inhibit the proliferation of nasal polyps epithelial cells by increasing PDL-1 pathway，and improve the ability of apoptosis.

Renal epithelial cells Cell proliferation Apoptosis @miR-425 @PDL-1

*新疆維吾爾自治區自然科學基金資助項目(2016D01C022)

腎上皮細胞 細胞增殖 細胞凋亡 @miR-425 @PDL-1

R623.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.006

(收稿：2017-04-01)