大尺寸骨軟骨復合支架修復羊膝關節骨軟骨缺損的初步研究*

邊衛國，鐘 亮，連 芩，邱裕生，靳忠民

1.西安交通大學第一附屬醫院(西安710061)，2.西安交通大學機械制造系統工程國家重點實驗室(西安710028)

△通訊作者

大尺寸骨軟骨復合支架修復羊膝關節骨軟骨缺損的初步研究*

邊衛國1，鐘 亮1，連 芩2△，邱裕生1，靳忠民2

1.西安交通大學第一附屬醫院(西安710061)，2.西安交通大學機械制造系統工程國家重點實驗室(西安710028)

目的：利用山羊膝關節大面積骨軟骨缺損模型評價大尺寸仿生水凝膠/聚乳酸/β-磷酸三鈣(PEG/PLA/β-TCP)復合支架軟骨再生修復效果和安全性。方法：選取約1歲齡健康雄性關中山羊3只，體重為35～40 kg，采用開放手術方式，將支架植入缺損區，術后當天及術后6月X線檢查；術后觀察動物功能康復；術后12月處死動物，并進行大體標本評測，組織學檢測，根據國際軟骨修復協會(ICRS)大體評估及組織學評分標準進行量化評分。結果：術后動物無感染和死亡，術后2周術側肢體自然負重行走，術后12月，術側肢體行走、奔跑與對側相似，無明顯跛行。術后6月X線示大尺寸PEG/PLA/β-TCP復合支架仍然固定良好，未出現支架破碎崩解等現象。術后12月，術側膝被動屈、伸運動范圍與對側肢體相似。大體觀察術側膝關節骨軟骨缺損被新生修復組織填充，與周圍正常組織連接，高度基本持平。但修復表面呈纖維化表面和小區域瘢痕組織及裂痕。ICRS軟骨修復大體評分分別為6、9、8分。組織學染色及Ⅱ型膠原免疫組化示：新生修復組織表面凹凸不平，缺損修復內可見纖維軟骨細胞與部分透明軟骨細胞，基質染色淡，軟骨層與軟骨下骨交界區整合連續性較差，Ⅱ型膠原免疫組織化學染色呈弱陽性。V-G染色示TCP骨支架周圍及其內部有新生膠原纖維長入。結論：大尺寸PEG/PLA/β-TCP復合支架植入山羊膝關節缺損處后具有良好的固定性及組織相容性。支架的仿生設計和固定裝置為植入初期提供了良好的力學支持，后期可誘導周圍細胞的遷徙與增殖。術后骨軟骨缺損被新生軟骨樣組織填充，手術膝關節功能長期良好。

關節軟骨是一種缺乏血供、神經支配、自我增殖更新能力弱的穩定組織，一旦由于感染、創傷等因素造成關節軟骨的破壞，難以通過自身能力進行修復、再生[1]。目前針對關節骨軟骨損傷的臨床治療方法和研究有很多，微骨折術、鉆孔術、骨軟骨移植等[2-4]。但各治療方式的修復效果無法令人滿意及尚存在著許多不足。本研究采用一種大尺寸仿生水凝膠/聚乳酸/β-磷酸三鈣(PEG/PLA/β-TCP)復合支架，利用該支架一體化的仿生設計，在不添加、負荷任何種子細胞及細胞因子的基礎上，植入動物模型，對山羊膝關節大面積骨軟骨缺損進行再生修復，初步探討及評估該大尺寸復合支架對關節骨軟骨缺損的再生修復效果。

材料與方法

1 實驗材料 選取12月齡健康雄性關中山羊3只，體重 35～40 kg，動物實驗經西安交通大學第一附屬醫院實驗動物實驗管理委員會批準，實驗實施遵循《實驗動物保護與應用指南》。大尺寸水凝膠/聚乳酸/β-磷酸三鈣復合支架(大尺寸PEG/PLA/β-TCP復合支架，見圖1)由西安交通大學機械制造系統工程國家重點實驗室連芩教授提供。PEG軟骨支架厚3.5 mm；β-TCP骨支架為20 mm×15 mm×10 mm；PLA固定樁高22 mm，直徑4 mm。生物陶瓷支架內部含有初級管道和次級管道直徑0.5 mm，初級管道供細胞黏附及組織長入；次級管道用于灌注PLA，提高β-TCP支架的力學強度；PEG軟骨支架通過水凝膠管道與β-TCP骨支架結合。

圖1 大尺寸PEG/PLA/β-TCP復合支架實物圖

2 手術操作及術后護理 行右膝前正中切口，內側切開關節囊，逐層切開，使髕骨向外側脫位，顯露股骨內側髁，將軟骨截骨導板安置于右膝股骨內側髁，確定支架植入位置(見圖2 A)。用擺鋸沿劃線位置進行切割，制造出與支架大小及外觀一致的大面積骨軟骨缺損，缺損范圍約15 mm×20 mm，深約10 mm。缺損處安放試件(見圖2 B)。利用標配鉆頭通過導板上的兩個定位孔進行打孔(深約10 mm，直徑約4 mm)。去除殘留的軟骨碎片及骨屑，生理鹽水沖洗(見圖2C)。將已消毒的浸泡在PBS中的支架通過壓配方式植入制備的骨軟骨缺損處，確保植入后復合支架高度與周圍正常軟骨表面平齊(如圖2D)。髕骨復位，檢查膝關節活動及髕骨軌跡有無異常，植入物有無脫落。依次關閉傷口。術后分欄飼養，術后每天給予肌注青霉素1次(5～10萬U/kg)預防術后傷口感染。

A：暴露內側髁按照模具劃定缺損范圍；B：截骨；

3 術后檢測 密切觀察實驗動物的精神、飲食、切口愈合情況及膝關節活動情況。術后當天及術后6月行患肢膝關節X線檢查，觀察支架植入固定情況。術后12月處死動物，離斷的雙側后肢(支架植入側肢體為實驗組，對側膝關節肢體為對照組)。之后打開關節腔，觀察有無積液，滑膜、半月板及缺損修復區域的大體情況，根據ICRS軟骨修復大體評估標準進行評分。以股骨內側髁骨軟骨缺損處為中心，用電鋸采集新生軟骨及軟骨下骨的骨軟骨塊(約2 cm×2 cm×2 cm大小)，放入10%中性福爾馬林中固定，而后分別進行HE染色、甲苯胺藍染色、番紅O染色、免疫組化染色、V-G染色。

結 果

1 術后一般情況及軟骨修復大體評分 術后2周活動基本接近正常，手術切口愈合良好，術側膝關節未見感染。術后12月術側膝關節主被動伸直、屈曲運動、活動范圍與對側膝關節基本一致；關節周圍皮膚無紅腫及異常分泌物；打開關節囊，可見關節囊無增厚或攣縮、髕骨無脫位、關節腔內無感染及滲出、滑膜無粘連(見圖3)。ICRS軟骨修復大體評分，見表 1。

2 術后X線檢查結果 術后當天X線片檢查示：植入物固定牢靠，無脫出、變形；動物膝關節骨性結構對合良好；術后6月X線檢查示：支架在股骨內側髁固定良好，外形存在，無脫出、無崩塌變形；術側膝關節間隙存在，骨性結構對合良好，關節腔內無異物、無骨贅形成。見圖 4。

圖3 大體標本觀察

實驗動物大體評估分值總體修復評估山羊A6Ⅲ級：異常山羊B9Ⅱ級：接近正常山羊C8Ⅱ級：接近正常

A：術后當天；B：術后6月

3 術后組織學結果 術后12月，實驗組標本組織學染色示組織標本著色可，新生軟骨修復組織表面不平整，厚度較周圍正常軟骨薄，部分修復組織可見裂隙、凹陷；修復組織以透明樣軟骨和纖維軟骨混合而成，細胞排列欠規整。實驗組有新生的軟骨下骨形成，并逐漸向缺損中心相互靠近，有類似于正常軟骨下骨的骨板結構形成。Ⅱ型膠原免疫組織化學染色呈弱陽性(見圖5)。V-G染色結果：骨組織內可見部分未被吸收、殘留的TCP陶瓷支架，其內及周圍有大量新生膠原纖維的長入(見圖 6)。

A：HE染色40×；B：番紅O染色40×；

A：正常松質骨40×；B、C、D： 植入區域軟骨下骨100×

討 論

臨床上通常認為軟骨內無血液供應，自身愈合能力差，直徑超過4 mm的軟骨缺損不能完全自我修復，損傷后，會導致關節腫脹和疼痛，影響運動功能，不及時治療，最終發展為骨性關節炎[5]。為了更好的驗證仿生軟骨/骨梯度組織工程支架的骨軟骨缺損修復能力，本研究選擇了以山羊為實驗動物，在與人軟骨損傷，退變好發部位股骨內側髁相似的羊股骨內側髁關節面，利用擺鋸制造大尺寸的缺損模型，缺損范圍約15 mm×20 mm，深約10 mm，其面積為3 cm2，達到中等面積軟骨缺損。其中包含了軟骨層，軟骨下骨板與軟骨下松質骨。鉆孔后，骨髓內的軟骨源性和骨源性細胞滲透到損傷區，所滲出的血凝塊附著到周圍正常關節軟骨邊緣以及支架內，為支架提供自體的干細胞。該復合支架采用仿生設計，包括支架結構和材料性能上的仿生，植入過程未負荷種子細胞。

研究結果顯示，大尺寸仿生PEG/PLA/β-TCP復合支架的初步修復效果值得肯定：首先，術后12月，山羊術側肢體的活動、被動屈伸運動與對側肢體相似，未出現跛行及行走明顯異常。其次，支架植入后，固定良好，植入初期未出現支架脫落、崩解等情況，并能為缺損處組織提供力學支撐。此外，影像學檢查發現，支架植入后期，骨軟骨缺損缺損處的支架大部分已被吸收降解，并伴隨有新生組織的長入。組織學檢測顯示：術后12月，實驗組標本組織學染色示組織標本著色可，新生軟骨修復組織完全覆蓋缺損區域，但表面不平整，厚度較周圍正常軟骨薄，部分修復組織可見裂隙、凹陷；修復組織以透明樣軟骨和纖維軟骨混合而成，細胞排列欠規整。實驗組有新生的軟骨下骨形成，并逐漸向缺損中心相互靠近，有類似于正常軟骨下骨的骨板結構形成。Ⅱ型膠原免疫組織化學染色呈弱陽性。骨軟骨界面的仿生結構保證了軟骨支架穩定的結合與深層軟骨細胞的營養供應。β-TCP支架骨支架的彈性模

量與軟骨下骨板類似，為表層軟骨支架內部的軟骨細胞生長、分化，新生軟骨組織功能化，提供了有效地應力刺激。隨著陶瓷支架的降解，接近于陶瓷面的細胞在應力刺激下向骨方向轉化，最終形成了一層微結構類似于軟骨下骨板的結構，該結構與新生的軟骨組織緊密結合，其結合方式類似于自然骨軟骨。軟骨的抗壓性能與彈性主要由軟骨內水分的滲流和軟骨基質的形變來承擔，這二者均與軟骨內占干重百分之60%～70%的膠原顯微結構密切相關[6]。近似于自然狀態膠原纖維微結構是新生軟骨實現功能化的表現之一，也是骨軟骨缺損修復，關節功能正常化的保證。軟骨下骨組織的重建：軟骨下骨的重建與軟骨層的修復共同發生，組織學染色示新生修復組織具有類似軟骨下骨板結構；V-G染色示陶瓷支架內部及周圍有大量膠原的長入，骨小梁作為骨中最重要的結構，其內部就是由大量膠原按照一定方式排列，表面覆蓋大量礦物質，所形成的三維網狀結構。

但實驗研究過程中，仍發現一些問題。首先，PEG吸水膨脹的系數不可控：實驗開始前，預先將制造好的干燥的大尺寸PEG/PLA/β-TCP復合支架浸泡在PBS液中，使水凝膠進行充分吸水膨脹。但是，由于水凝膠良好的吸水膨脹特性及其膨脹程度的不可預測性，待取用支架時，發現PEG軟骨支架厚度明顯增加，因而為了使PEG軟骨支架高度與周圍正常軟骨層高度相當，不得不進行修剪，該修剪的結果可能會影響PEG軟骨支架在初期對關節軟骨仿生功能的影響。

[1] Filardo G，Perdisa F，Roffi A，etal. Stem cells in articular cartilage regeneration[J]. Journal of Orthopaedic Surgery and Research，2016，11(1):1-15.

[2] 馬樹強，姬海鵬，王坤正，等.骨-骨膜復合組織與軟骨下鉆孔治療關節軟骨缺損的實驗研究[J].陜西醫學雜志，2004，33(5)：390-392.

[3] Sakata R，Iwakura T，Reddi AH. Articular Cartilage Regeneration: Challenges and Opportunities[J].Tissue Engineering Part B Reviews，2015，21(5)：461.

[4] Correa D，Lietman SA. Articular cartilage repair: Current needs，methods and research directions[J]. Seminars in Cell & Developmental Biology，2016，62:67-77.

[5] 朱長寶.軟骨微粒復合仿生基質溶膠體外構建組織骨可行性研究[D].重慶：第三軍醫大學，2015.

[6] Little CJ，Bawolin NK，Chen X.Mechanical properties of natural cartilage and tissue-engineered constructs[J]. Tissue Engineering Part B Reviews，2011，17(4):213.

*國家自然科學基金資助面上項目(81672187)

優秀重點實驗室資助項目(51323007)

骨和骨組織 軟骨 創傷和損傷 組織工程 支架 山羊

R683

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.008

(收稿：2017-03-03)