高通量測序平臺對卵巢癌基因突變的檢測及意義*

姜向陽，李興珍，劉文康，吳志新，李帥帥，張恩科，趙清俠

陜西省人民醫院(西安710068)

△通訊作者

高通量測序平臺對卵巢癌基因突變的檢測及意義*

姜向陽，李興珍，劉文康，吳志新，李帥帥，張恩科，趙清俠△

陜西省人民醫院(西安710068)

目的：利用高通量測序平臺研究卵巢癌基因突變的分布和特點，尋找相應的突變靶點，并對突變位點的類型和頻度進行分析。方法：取自臨床上卵巢癌的組織石蠟標本16例，運用高通量基因測序Ion torrent PGM平臺，對50個基因2835個位點進行檢測。結果：50個基因中突變集中在EGFR、KDR 、KIT、KRAS、NOTCH1、SMAD4、TP53等7個基因21個位點上。其中TP53突變比例高達75%，且突變點是4號外顯子c.215C>G的比例最高。結論：卵巢癌患者可以根據基因突變靶點進行精準治療，TP53的高突變比例提示其在腫瘤的發生發展中起著重要的作用，結合臨床可為復發轉移預測提供依據。

近30年來卵巢癌病因學的認知，復雜的異質性、腫瘤微環境的特異性等生物學特性研究不斷深化[1]，手術及化療方案都有了很多的改進[2]，但是患者的生存率沒有太大的變化。靶向治療能影響腫瘤細胞、基質、血管或細胞信號傳導通路。研究發現，血管內皮細胞生長因子(VEGF)在卵巢癌中過度表達，并與順鉑耐藥性的增加有關，貝伐單抗能靶向作用于 VEGF-A 的活性形式，從而抑制血管生成和腫瘤的生長，抑制轉移擴散，患者的無進展生存期增加[3]。從基因的表達到DNA測序，從焦磷酸測序，Sanger測序到高通量測序(High-throughput sequencing)又名下一代測序(Next generation sequencing，NGS)，技術平臺有了突飛猛進的發展。本研究運用NGS平臺，檢測卵巢癌患者的基因突變圖譜，尤其是TP53的突變分析，結合病理及臨床分型，藥物療效等方面，探討TP53的突變情況及與卵巢癌，尤其是上皮性卵巢癌的相關性。

對象和方法

1 研究對象 腫瘤標本全部來源于我院2014年5月至2016年6月收治的16例上皮性卵巢癌患者，年齡38～81歲，平均(60.31±5.53)歲。病理分型：低分化腺癌13 例，高分化腺癌2 例，顆粒細胞瘤1例；上皮性卵巢癌14例，顆粒細胞瘤1例，胃轉移卵巢癌1例。臨床分期：ⅡC 2 例，ⅢC 13例，Ⅳ期1例。淋巴轉移3例，復發7例，腹腔轉移1例，肝轉移1例，肺轉移1例，未復發2例，因肺部感染死亡1例。

2 研究方法 ①DNA準備：為保證FFPE切片組織中含有足夠比例的腫瘤細胞，需請病理科事先對該切面的腫瘤組織進行HE染色，確保所切層面中腫瘤組織占70%以上、且壞死組織比例少于10%。采用切片厚度5～10 μm，數量6～8張。②DNA提取：采用QIA amp DNA Mini Kit (Qiagen)試劑盒對組織進行DNA提取。③質控：DNA定量(Qubit2.0)Agilent2100質控，提取片段長度在170 bp左右，組織樣本DNA的Qubit定量濃度>50 ng/μl。④Ion文庫構建：采用AmpliSeqTMLibrary Kit2.0(Life Technologies 生產 )標準試驗方案建庫。⑤測序：高通量測序樣品上機深度測序(測序儀：Ion Torrent PGMTM)；測序結果質控(長度分布，QC均一性，測序堿基質量，Amplicons覆蓋度等)。比對率>95%、reads長度主要分布在100 bp左右、GC含量均一、Q>20、覆蓋度：組織>1000×。

3 統計學方法 使用北京圣谷同創科技發展有限公司自主研發的SV-DNA filter進行背景突變過濾，保證突變檢出的敏感度、準確性及腫瘤相關性；對最終的突變點進行計算統計比較分析。

結 果

1 基因突變譜檢測 高通量測序平臺檢測國內外研究熱點的50個基因，覆蓋2835個位點，共檢測了16例卵巢癌患者的基因突變譜。檢測的50個基因中，發生突變的基因有7個，見表1。

表1 發生突變的基因分布比例

2 TP53突變分布 見表2。TP53突變頻率較高，在檢測的16例卵巢癌患者中有12例發生了TP53基因突變，其中3例在2個外顯子上發生了突變，突變數量為15個。突變的外顯子涉及5個，分別是Exon4、5、6、7、8，突變類型為錯義突變和刪除(缺失)突變。

表2 TP53突變分布[突變(%)]

3 TP53突變位點分布 TP53的錯義突變位點多集中在4號外顯子第215號核苷酸，C突變為G，與之對應的72號氨基酸由脯氨酸突變為天冬氨酸(c.215C>G，p.72P[Pro]=>R[Arg])。

討 論

本次研究檢測50個腫瘤相關基因的2835個位點，卵巢癌的突變集中在EGFR、KDR 、KIT、KRAS、NOTCH1、SMAD4、TP53等7個基因，針對靶點的藥物治療，成為精準個體化治療的一部分，并取得了可靠的患者反饋。1例EGFR基因21號外顯子c.2573T>Gp.858L突變給予酪氨酸激酶抑制劑，KDR基因7號外顯子c.889G>Ap.297 突變應用抗VEGF類藥物療效顯著，毒副作用較少，患者主觀感受較好。

P53蛋白約為53千道爾頓(53kD)，是由TP53基因編碼的，定位于人17號染色體短臂的pl3.1上，它對于抑制癌癥的發生發揮著十分關鍵的作用。在超過半數的人類腫瘤中，P53都表現為突變或者基因的缺失[4]。突變的P53不僅喪失了并抑制野生型P53抑制腫瘤的功能，它同時表現為獲得性的新功能。這種獲得性功能在腫瘤發生發展的各個階段發揮著重要的促進作用[5]。TP53基因的突變形式各異，位點分布也不相同。本研究中TP53基因突變率高達75%，16例患者有1例是初診，于2016年5月行卵巢減滅術；15例患者均在2011-2015年做過卵巢腫瘤減滅術，術后復發7例，6例發生轉移；2例未復發轉移的患者為2015年初診發現腫瘤，且TP53基因均有突變。復發轉移率81.25%，13例轉移復發的患者中11例發生了TP53基因的突變，突變率為84.62%。卵巢顆粒細胞瘤是卵巢性索間質腫瘤中常見的腫瘤，屬于低度惡性，復發幾率較低，本研究中有1例，TP53基因4號外顯子上發生了c.215C>Gp.72和 c.314delGp.105fs錯義和缺失突變，該患者減瘤術后復發，以上結果顯示TP53基因與卵巢腫瘤的發生發展密切相關。

有文獻報道，在消化系統腫瘤中的TP53突變頻率較高，多在5、6、7、8外顯子的不同位點上[6]。本研究顯示TP53突變高發在4號外顯子的215核苷酸序列上，是不是提示卵巢癌的突變有差異性，我們將進一步關注。

卵巢癌手術減瘤后，開展聯合治療，依據高通量基因檢測突變信息，篩選靶向藥物，制定個體化的用藥方案[7]，做到“精準治療”，提高患者的治療依從性，減少化療藥物毒副作用，提高5年生存率。同時結合腫瘤標志物，還未發生轉移或復發的患者，進行預測、早期發現、早期干預；結合NGS平臺提供的基因測序大數據分析，綜合臨床資料的研究，更好的為患者服務。

[1] Nurul-Syakima AB，Mutalib B.Molecular characterization of serous ovarian carcinoma using a multigene next generation sequencing cancer panel approach[J].BMC Research Notes，2014，7：805.

[2] 華 瑛，姚安梅，楊 浩.紫杉醇聯合順鉑或奈達鉑治療晚期卵巢癌臨床對比觀察[J].陜西醫學雜志，2013，42(11)：1533-1534.

[3] Hamerlik P，Lathia JD，Rasmussen R，etal.Autocrine VEGF-VEGFR2-Neuropilin-1 signaling promotes gliomastem-like cell viability and tumor growth [J] . J Exp Med，2012，209(3)：507-520.

[4] Stijn C.Target-Enriched Next-Generation Sequencing Reveals Differences between Primary and Secondary Ovarian Tumors in Formalin-Fixed，Paraffin-Embedded Tissue[J].JMD，2015，17(2)：193-200.

[5] Sunghee W.Proteogenomic strategies for identification of aberrant cancer peptides using large-scale next-generation sequencing data[J].Proteomics，2014，14(23)：2719-2730.

[6] Xu Z，Huo XY，Ye H，etal.Genetic Mutation Analysis of Human Gastric Adenocarcinomas Using Ion Torrent Sequencing Platform [J]. PLOS ONE，2014 9(7)：e100442.

[7] 蔡祖艾，王 琪，張 瑋，等.以基因通路富集法探索上皮性卵巢癌多藥耐藥相關生物學通路及功能性SNP位點[J].中國癌癥防治雜志，2014(2)：127-132.

Geneticmutationanalysisofhumanovariancancerusingnext-generationsequencingplatform

Jiang Xiangyang，Li Xingzhen，Liu Wenkang，et al.

Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an 710068)

Objective：Using NGS sequencing platform，study the distribution and characteristics of ovarian cancer gene mutations and look for targets of medicines; by analysis the mutation sites，types and frequency ，combined with the tumor markers，predict the recurrence or metastasis，then screening，early intervention on a regular basis.Methods：16 cases from ovarian tissue paraffin specimens by clinically confirmed，using the high-throughput sequencing Ion torrent PGM platform，test the 2835 gene loci of 50 genes and the data analysis. Results：50 genes mutations were in the concentrated in EGFR，KDR，KIT，KRAS，NOTCH1 and SMAD4，TP53 seven 21 gene loci. TP53 mutations among the proportion were as high as 75%，and mutation of 4 exon c.215C>G has the highest percentage. Conclusion：The patients with ovarian cancer can be according to the target gene mutations in accurate treatment，TP53 high mutation rate suggests it plays an important role in the occurrence of tumor development，combined with clinical study can provide the basis for recurrent branch predictions.

Ovarian neoplasms Gene conversion High-throughput nucleotide sequencing Genes，p53

*西安市科技計劃項目[SF1510(3)]

卵巢腫瘤 基因轉變 高通量核苷酸測序 基因，p53

R737.31

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.009

(收稿：2017-02-13)