microRNA217逆轉人宮頸癌細胞順鉑耐藥及其作用機制

張婷婷，彭慧霞

西安交通大學第二附屬醫(yī)院婦產科(西安710004)

△通訊作者

microRNA217逆轉人宮頸癌細胞順鉑耐藥及其作用機制

張婷婷，彭慧霞△

西安交通大學第二附屬醫(yī)院婦產科(西安710004)

目的:探討microRNA217(miR-217)與宮頸癌順鉑耐藥的關系及其可能作用機制。方法:建立具有不同順鉑耐藥性的細胞株Siha及Siha/CDDP，采用實時熒光定量PCR法檢測miR-217在其中的表達差異。采用實時定量PCR及Western blot法分別在核酸和蛋白水平檢測果蠅zeste 基因增強子同源物2(EZH2)在Siha及Siha/CDDP細胞系的表達差異。通過轉染miR-217模擬物 (miR-217mimics) 檢測其對宮頸癌耐藥的作用及其可能作用靶點。結果:相較于Siha細胞，Siha/CDDP細胞中miR-217呈低表達，而EZH2在核酸和蛋白水平均相對高表達 (P<0.05)。Siha/CDDP細胞轉染miR-217 mimics后，EZH2在核酸及蛋白水平均明顯下降(P<0.05)，對順鉑的敏感性顯著增強 (P<0.05)。結論: 在Siha/CDDP中上調其表達可部分逆轉順鉑耐藥性，這可能為宮頸癌耐藥的臨床前期研究提供新的靶點，miR-217可能通過作用于EZH2參與宮頸癌順鉑耐藥的調控。

microRNAs(miRNAs)是一組非編碼保守小RNAs，可通過與同源性mRNA靶點上的3＇未翻譯區(qū)(UTRs) 進行序列特異性的結合[1]。近年來，已有大量研究發(fā)現(xiàn)miRNAs可通過調控癌基因/抑癌基因繼而調控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及放化療敏感性等生物學行為。miR-217位于染色體2P16.1上，目前已有部分研究表明其在腫瘤進展過程中可能起到重要作用[2]。本研究旨在探討miR-217在宮頸癌順鉑耐藥細胞中的作用及其機制。

材料和方法

1 材 料 人宮頸癌細胞株Siha(ATCC公司)。RNAiso 小RNA 提取試劑、PrimeScript miRNA 反轉錄試劑盒、SYBRPremix Ex Taq 試劑盒、miR-217引物(TaKa-Ra) ; 6 孔板、24 孔板、96 孔板(Costar) ; MTT(南京凱基) ; 二甲基亞砜(DMSO)(Sigma) ; 酶標儀(Invitrogen) 。EZH2單克隆抗體(Cell Signaling Technology，USA); β-actin 單克隆抗體(sc-130756，Santa Cruz); 羊抗鼠抗體(sc-130656，Santa Cruz)。

2 實驗方法 ①宮頸癌耐順鉑細胞株的誘導：利用低濃度加量持續(xù)誘導法產生人宮頸癌耐 CDDP細胞株[3]。誘導方法如下: 0. 1μg/ml 順鉑處理宮頸癌細胞Siha 2 周，0. 5 μg/ml 處理 6 周，1 μg/ml 處理12 周，2 μg/ml 處理8 周，4 μg/ml 處理 12 周。經過總共 40 周的誘導，Siha細胞可在含CDDP (4 μg/ml) 的培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長且正常傳代，成功建立了人宮頸癌耐順鉑細胞株Siha/CDDP。②細胞培養(yǎng)：Siha細胞培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)液(Gibco 公司)中加入 5%的小牛血清(Gibco 公司)以及100 U/ml青霉素和100 μg/ml 鏈霉素，在5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 耐順鉑細胞株Siha/CDDP 常規(guī)培養(yǎng)于含5%胎牛血清以及100 U/ml青霉素和100 μg/ml 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。每傳兩代在培養(yǎng)基中加入終濃度為4 μmol/L的順鉑以維持其耐藥性。③細胞轉染：取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化并計數(shù)，每孔接種5×104細胞，溫箱孵育細胞至70%豐度，分別取成熟miR-217的mimics/ inhibitors和NC(陰性對照) 各100 pmol與脂質體混勻后室溫下放置30 min，同時將細胞用無血清培養(yǎng)基漂洗2遍，將混勻后的脂質體用無血清培養(yǎng)基稀釋后小心加入漂洗過的細胞，之后將轉染后細胞置于溫箱中孵育24 h后換新鮮完全培養(yǎng)基。具體操作按 Lipofectamine2000 說明書進行。④實時熒光定量PCR：用TRIzol試劑提取細胞總RNA，檢測濃度與質量，OD值在1.8～2.2之間方可使用。用TaKaRa PrimeScript miRNA 反轉錄試劑盒合成cDNA。qRT-PCR檢測各組細胞中miR-217表達水平。反應條件: 95℃ 10 min預變性，95 ℃ 10 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 20 s 共40個循環(huán)。反應所得樣本和內參 U6 的結果分析采用 2-ΔΔCT方法。2-ΔΔCT表示各標本實驗組與對照組比較的相對表達量，每組實驗重復 3 次。⑤Western blot：收集細胞樣本，用RIPA裂解液提取細胞總蛋白。4 ℃離心機離心棄去沉淀，收集蛋白后BCA法定量分析蛋白濃度。制備10%SDS-PAGE膠，上樣于泳道后100 V恒壓分離后轉PVDF膜，接著在PBS/Tween-20中用5%脫脂牛奶封閉2 h，加鼠抗人EZH2單克隆抗體和鼠抗人β-actin 單克隆抗體4 ℃過夜。加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體(sc-130656，Santa Cruz) ，室溫孵育1 h 洗膜后顯影。用BandScan圖像分析系統(tǒng)掃描圖像的光密度，以各組目的蛋白條帶光密度值與內參蛋白(β-actin) 光密度值計算相對比值。⑥MTT實驗：取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后用培養(yǎng)基調整其濃度至5×104/ml。按每孔100 μl細胞懸液(約每孔5000個細胞)接種于96孔板。將96孔板置于培養(yǎng)箱24 h后，細胞貼壁，棄去原培養(yǎng)基后加入終濃度為 1、10、 20、50、100 μmol/L的順鉑，每個濃度設6個復孔，同時設調零孔(即不加細胞組)、對照孔(即僅加入最大濃度藥物溶解介質的細胞孔)。 48 h后加 20 μl/孔 MTT(5 mg/ml)，溫箱孵育3 h，終止培養(yǎng)后小心吸去孔內培養(yǎng)液，每孔加150 μl DMSO。置于溫箱孵育10 min后用酶標儀檢測。在 490 nm 波長處讀數(shù)。繪制藥物劑量反應曲線，計算細胞半數(shù)抑制濃度(IC50) ，每個實驗重復3次。⑦細胞生長及存活性檢測：取轉染后Siha/CDDP細胞，加10 μmol/L順鉑作用5 d。在不同時間點用胰酶消化細胞后制成細胞懸液。細胞懸液與0.5% Trypan Blue溶液以9∶1混合均勻，調節(jié)其終濃度為0.05%。在3 min內用細胞計數(shù)器分別計數(shù)活細胞及死細胞。鏡下觀察，活細胞呈無色透明狀，死細胞被染成藍色。統(tǒng)計細胞活力：活細胞率(%)=活細胞總數(shù)/(活細胞總數(shù)+死細胞總數(shù))×100%。每個實驗重復3次。

3 統(tǒng)計學方法 用 SPSS 16.0 統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，兩組數(shù)據(jù)比較采用 Student＇st檢驗，多組間資料比較采用 One-way ANOVA 單因素方差分析(LSD法) 。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 miR-217在宮頸癌細胞中的表達 見圖1。在宮頸癌細胞Siha及宮頸癌耐藥細胞Siha/CDDP中miR-217均有表達，實時熒光定量PCR結果顯示miR-217在Siha/CDDP細胞中低表達，相對表達水平較Siha細胞降低約50%，兩者比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

*P<0.05

2 EZH2在宮頸癌耐藥細胞株Siha/CDDP中的表達 實時熒光定量PCR檢測顯示：在Siha/CDDP細胞中EZH2 mRNA表達水平高于Siha細胞株(P<0.05)，見圖2A。Western blot蛋白水平檢測顯示：Siha/CDDP細胞中EZH2蛋白表達高于Siha細胞株(P<0.05)，見圖2B。

A：實時熒光定量PCR檢測；B：Western blot 檢測

3 轉染miR-217mimic 后Siha/CDDP細胞中EZH2的表達情況 見圖3。轉染miR-217mimic后Siha/CDDP細胞中EZH2的mRNA及蛋白表達水平均顯著下降，與Siha相比有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

A：實時熒光定量PCR檢測；B：Western blot 檢測

4 轉染miR-217mimic后Siha/CDDP細胞耐藥性變化 miR-217 組IC50為12.98 μmol/L，較對照組(23.21 μmol/L)顯著下降(P<0.05)，見圖4A。轉染miR-217mimic 后的Siha/CDDP細胞用順鉑作用48 h后存活率較對照組顯著降低(P<0.05)，見圖4B。

A：MTT 法檢測轉染miR-217 后Siha/CDDP細胞的耐藥性;B：順鉑轉染miR-217的Siha/CDDP細胞存活率

討 論

目前已有研究表明miR-217過表達可通過調控PTEN信號通路參與肝癌耐藥及其侵襲轉移[4]；在肺癌中，miR-217作為抑癌基因參與腫瘤順鉑耐藥[5]；在胃癌中，miR-217通過調控EZH2從而抑制腫瘤進展及轉移[6]。但目前關于miR-217在宮頸癌細胞中對順鉑耐藥性的調控尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-217在宮頸癌順鉑耐藥細胞株Siha/CDDP中的表達降低，而在耐藥株中過表達miR-217可增強其對順鉑的耐藥性。

EZH2是多硫基因(PcG)家族的重要成員，可通過過位點特異性地將組蛋白H3上第27位賴氨酸殘基(H3-K27)甲基化而改變染色質的構象，促進腫瘤的增殖、抑制腫瘤細胞的凋亡[7-8]。目前已有大量研究認為EZH2在多種腫瘤中過表達，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預后等過程中起重要作用[9]。Cai等[10]發(fā)現(xiàn)EZH2可逆轉宮頸癌的腫瘤化療抵抗。本研究通過靶基因預測軟件發(fā)現(xiàn)EZH2可能是miR-217的潛在靶基因之一，因此我們推測miR-217在EZH2高表達的宮頸癌順鉑耐藥細胞株(Siha/CDDP)中的異常表達可能與腫瘤耐藥相關。本研究結果顯示，在Siha/CDDP細胞中過表達 miR-217后，EZH2在mRNA水平及蛋白水平的表達均明顯下降。這些結果表明miR-217可能通過負調控EZH2而增強Siha/CDDP細胞的順鉑敏感性。

綜上所述，miR-217在宮頸癌鉑類耐藥細胞株Siha/CDDP中低表達，而在Siha/CDDP中上調其表達可部分逆轉順鉑耐藥性，這可能為宮頸癌耐藥的臨床前期研究提供新的靶點。此外，miR-217可能通過作用于EZH2 參與宮頸癌順鉑耐藥的調控，其具體調控機制尚待進一步研究。

[1] Guo Z，Shu Y，Zhou H，etal.Identification of diagnostic and prognostic biomarkers for cancer: Focusing on genetic variations in microRNA regulatory pathways (Review)[J].Molecular Medicine Reports，2016，13(3)：1943-1952.

[2] 盧燕華. miR-217與MAPK1在胃癌中的表達及調控研究[D].南華大學，2015.

[3] 陳新蓮，王 和，張雪梅，等.人宮頸癌順鉑耐藥細胞系 SiHa/cDDP 的建立[J].四川大學學報: 醫(yī)學版，2012，43(2)：151-155.

[4] Xia H，Ooi LLPJ，Hui KM.MicroRNA-216a/217-induced epithelial-mesenchymal transition targets PTEN and SMAD7 to promote drug resistance and recurrence of liver cancer[J].Hepatology，2013，58(2)：629-641.

[5] Guo J，F(xiàn)eng Z，Huang Z，etal.MicroRNA-217 functions as a tumour suppressor gene and correlates with cell resistance to cisplatin in lung cancer[J]. Molecules and Cells，2014，37(9)：664-671.

[6] Chen DL，Zhang DS，Lu YX，etal.microRNA-217 inhibits tumor progression and metastasis by downregulating EZH2 and predicts favorable prognosis in gastric cancer[J].Oncotarget，2015，6(13)：10868-10879.

[7] Jiang T，Wang Y，Zhou F，etal.Prognostic value of high EZH2 expression in patients with different types of cancer: a systematic review with meta-analysis[J]. Oncotarget，2016，7(4)：4584-4597.

[8] Han LC，Chen Y.Targeting EZH2 for cancer therapy: progress and perspective[J].Current Protein & Peptide Science，2015，16(6):559-570.

[9] Volkel P，Dupret B，Le Bourhis X，etal.Diverse involvement of EZH2 in cancer epigenetics[J].American Journal of Translational Research，2015，7(2)：175-193.

[10] Cai L，Wang Z，Liu D.Interference with endogenous EZH2 reverses the chemotherapy drug resistance in cervical cancer cells partly by up-regulating Dicer expression[J].Tumour biology，2016，37(5):6359-6369.

(收稿：2017-04-25)

子宮頸腫瘤 順鉑 抗藥性，腫瘤 微RNAs 分子藥理作用機制

R737.33

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.010