NVP-BEZ235對人結腸癌細胞SW480體外增殖的抑制作用及其機制探討

馬善義，孫兆樓

安徽省宣城市中心醫院腫瘤科(宣城242000)

NVP-BEZ235對人結腸癌細胞SW480體外增殖的抑制作用及其機制探討

馬善義，孫兆樓

安徽省宣城市中心醫院腫瘤科(宣城242000)

目的：探討NVP-BEZ235對人結直腸癌細胞株SW480的抑制、凋亡作用及其可能的作用機制。方法：以不同濃度的NVP-BEZ235處理體外人結直腸癌細胞株SW480，分別用MTT法、流式細胞術和Western blot法檢測NVP-BEZ235對SW480細胞的增殖抑制作用、細胞凋亡率和凋亡相關蛋白的表達。結果：NVP-BEZ235對人結直腸癌細胞株SW480的生長具有顯著的抑制活性，誘導其凋亡，抑制p-Akt、p-p70S6K蛋白的表達，且均與藥物濃度和作用時間呈正相關。結論：NVP-BEZ235具有抑制人結直腸癌細胞株SW480的生長作用并誘導其凋亡，且機制可能是通過抑制p-Akt、p-p70S6K蛋白的表達來實現的。

結直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，目前，傳統的治療手段包括手術、化療和放療，但對于腸癌患者生存期沒有明顯改善，中位生存期不足20個月[1]。近年來，隨著分子靶向藥物的出現，例如針對表皮生長因子受體(EGFR)的單克隆抗體對腸癌晚期患者有明顯療效，使其中位生存期達到2年[2]，但由于KRAS等的突變導致抗-EGFR單克隆抗體耐藥的發生使得該靶向藥物治療效果大大降低。因此，尋找新的治療靶點已成為治療結直腸癌的關鍵。NVP-BEZ235是一種新型的PI3K和mTOR雙重抑制劑，可競爭性結合ATP結合位點，特異性地抑制PI3K和mTOR的活性[3]。本文以結直腸癌細胞株SW480為研究對象，在細胞增殖、細胞凋亡以及細胞周期等方面研究NVP-BEZ235對結直腸癌的生長抑制作用，以及相關機制。

材料與方法

1 材 料 NVP-BEZ235購自Selleck Chemicals公司(Houston，TX，USA)，人結直腸癌細胞株SW480購于美國ATCC細胞庫，Hoechst 33342購自美國Sigma公司，BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo Fisher公司，Annexin V/PI 雙染凋亡試劑盒購于Invitrogen公司，AKT磷酸化抗體購自CST，ECL顯色液購自Thermo Scientific公司。

2 實驗方法 ①SW480細胞株培養：培養在10%的滅菌牛血清+50 U/ml青霉素+50 U/ml鏈霉素的RP-M11640的培養液中。置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。NVP-BEZ235的配制，NVP-BEZ235的CAS號為915019-65-7，分子式C30H23N5O，分子量469.6，稱取0.939 mg NVP-BEZ235溶解于100 ml DMSO中，配制20 μmol/L儲存液待用。②MTT法檢測NVP-BEZ235對SW480細胞的增殖抑制作用[4]：收集對數生長期SW480細胞，將細胞以100 μl/well接種于96孔板，使待測細胞密度為1×104/孔。5%CO2，37 ℃孵育12 h后，吸棄上清，然后加入不同濃度的NVP-BEZ235(0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 μmol/L)，分別設3個復孔。孵育72 h后，每孔加入20 μl 的5 mg/ml 濃度的MTT溶液。繼續37 ℃培養4 h后，棄孔內培養基，每孔再加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，置低速搖床上振蕩10 min，將試劑對照調零。用酶聯免疫檢測儀于490 nm處檢測各孔的吸光值。以下面公式計算細胞生存率：細胞生存率= (OD藥物作用孔-OD調零孔)/(OD對照孔-OD調零孔)×100%。以不同濃度的NVP-BEZ235為橫坐標，細胞抑制率為縱坐標，繪制細胞增殖抑制曲線圖。③流式細胞術檢測細胞凋亡率：6孔板中接種5×105個/ml的對數生長期SW480細胞，貼壁培養12 h后，在加藥組中分別加入1、5、10 μmol/L的NVP-BEZ235，對照組中加入等量的DMSO，在37℃、5%CO2條件下培養48 h，棄培養基，參考凋亡檢測試劑盒實驗操作說明：胰酶消化收集細胞，PBS洗滌細胞兩遍，用500 μl的1×Binding Buffer重懸細胞，加入5 μl的Annexin- V和10 μl的 PI，冰上避光15 min后，流式細胞儀上機分析。④Western Blot檢測細胞中有關蛋白的表達：收集對數生長期SW480細胞，按1×106接種至6 cm細胞培養皿，待細胞長到90%飽和時。分別用不同濃度的NVP-BEZ235(0.5、1、5、10 μmol/L)處理細胞，在5 %CO2、37 ℃培養箱中培養48 h，用預冷的PBS洗細胞兩遍后加入RIPA細胞裂解液(含10%蛋白酶抑制劑)，冰上放置30 min，期間搖晃2～3次。4℃，13000 g，離心20 min，收集上清，按BCA蛋白定量試劑盒操作說明進行蛋白濃度定量檢測。SDS凝膠每樣本加入20 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，在轉移至PVDF膜上，5%BSA室溫封閉3 h，加抗體(Caspase-8抗體、Caspase-3抗體、Akt抗體、p-Akt抗體、p70S6K抗體、p-p70S6K1抗體，1∶1000稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次后，加入HRP偶聯的二抗(1∶10000稀釋)，室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次后，加入ECL顯色試劑于Bio-Rad ChemiDox XRS掃膜儀上掃描目的蛋白的表達。

結 果

1 MTT法檢測NVP-BEZ235對SW480細胞的增殖抑制作用 見圖1。NVP-BEZ235能顯著抑制人結直腸癌細胞SW480的增殖，且隨著NVP-BEZ235濃度的增加和作用時間的延長，抑制效果更為顯著，即抑制率與藥物濃度-時間呈正相關，在72、96 h，NVP-BEZ235對SW480的IC50值分別為9.1和4.9 μmol/L。

圖1 不同濃度的NVP-BEZ235對SW480細胞的生長抑制作用

2 流式細胞術和Western blot檢測BEZ235誘導細胞發生凋亡 見表1、2。采用0、0.5、1.0、5.0、10 μmol/L濃度的NVP-BEZ235分別處理SW480細胞48 h。單因素方差分析顯示，各濃度組間細胞凋亡率比較差異有統計學意義(P<0.05)。LSD-t檢驗顯示，5、10 μmol/L濃度組細胞凋亡率均顯著大于0 μmol/L濃度組(P<0.05)。Western blot檢測顯示，各濃度組間細胞Caspase-8、Caspase-3表達比較差異有統計學意義(P<0.05)，LSD-t檢驗顯示，1、5、10 μmol/L濃度組細胞Caspase-8、Caspase-3表達均顯著大于0 μmol/L濃度組(P<0.05)。

表1 不同濃度NVP-BEZ235對SW480細胞凋亡的影響

注：與0 μmol/L比較，*P<0.05

表2 不同濃度NVP-BEZ235對SW480細胞Caspase-8、Caspase-3表達的影響

注：與0 μmol/L比較，*P<0.05

3 Western blot法檢測NVP-BEZ235對Akt、p-Akt、p70S6K、p-p70S6K蛋白的影響 見表3。采用0、0.5、1、5、10 μmol/L濃度的NVP-BEZ235處理人結腸癌細胞SW480，48 h后采用Western blot檢測Akt、p-Akt、p70S6K、p-p70S6K表達。單因素方差分析顯示，各濃度組間Akt和p70S6K蛋白表達無統計學差異(P>0.05)，而各濃度組間p-Akt和p-p70S6K表達存在統計學差異(P<0.05)。LSD-t檢驗顯示，5、10 μmol/L濃度組細胞p-Akt和p-p70S6K表達均顯著小于0 μmol/L濃度組(P<0.05)。

表3 不同濃度NVP-BEZ235對SW480細胞Akt、p-Akt、p70S6K、p-p70S6K表達的影響

注：與0 μmol/L比較，*P<0.05

討 論

NVP-BEZ235為咪唑喹啉類抗腫瘤化合物，主要作用于PI3K/mTOR信號通路。楊芬等[5]通過MTT法、Western blot法、DAPI染色法及TUNEL染色法研究發現，NVP-BEZ235可通過抑制PI3K/mTOR下游通路磷酸化過程達到選擇性的抑制鼻咽癌細胞的增值和誘導其凋亡。另有文獻報道，NVP-BEZ235可通過抑制PI3K/mTOR通路相關蛋白的表達，從而抑制淋巴瘤細胞(CA46、RAJI)、骨肉瘤細胞(MG-63、U2OS、SaOs-2)及突變乳腺癌細胞(MDA-MB361、MCF-7)的增值，并誘導癌細胞的凋亡[6-7]。

臨床研究表明，人結直腸癌中PI3K/AKT/mTOR信號通路的主要異常是PIK3CA基因突變以及PTEN表達的丟失，而PIK3CA突變與結直腸癌分化程度、病理類型有著密切的關系[8]。目前用于結直腸癌患者的靶向藥物主要為奧沙利鉑、卡培他濱等，雖具有一定療效，但副作用較大[9]。本課題探究了NVP-BEZ235對體外人結直腸癌細胞SW480的生長抑制及其可能的作用機制。實驗顯示，不同濃度的NVP-BEZ235對SW480細胞均具有抑制作用，且隨著劑量、作業時間增加，抑制作用也隨之增強。說明NVP-BEZ235 可以明顯抑制SW480細胞生長，并與劑量呈正相關。

細胞凋亡是一個受精確調控的程序性死亡的過程，研究已證實細胞凋亡與腫瘤的發生密不可分[10]。本研究采用流式細胞法，探究了不同劑量的NVP-BEZ235(0、0.5、1、5、10 μmol/L)對SW480細胞處理48 h后凋亡的情況。結果顯示，0.5～10 μmol/L 的NVP-BEZ235均可誘導SW480細胞發生凋亡，且隨著NVP-BEZ235濃度的增加，誘導凋亡效應增強，其中5、10 μmol/L的 NVP-BEZ235濃度對SW480凋亡率與0 μmol/L相比具有統計學差異。Caspase家族在正常的細胞中處于無活性狀態，而在細胞的凋亡過程中異常表達。本實驗通過Western blot法檢測發現，隨著NVP-BEZ235濃度的增加，SW480中凋亡啟動因子Caspase-8和執行因子Caspase-3的表達增強。說明NVP-BEZ235可能是通過活化Caspase-8，繼而活化Caspase-3來完成誘導細胞凋亡的。本研究也發現，NVP-BEZ235可抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路中的關鍵蛋白p-70S6K、p-Akt的表達，且與濃度呈正相關。

總之，通過本研究顯示，新型的PI3K和mTOR雙重抑制劑NVP-BEZ235對體外人結直腸癌細胞SW480的生長具有顯著的抑制作用，且促進其凋亡，可能是通過PI3K/AKT/mTOR信號通路實現的，具體的作用機制后期將會更深入的研究。

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(收稿：2017-04-10)

InhibitoryandmechanismofNVP-BEZ235onproliferationofhumancoloncancercelllineSW480

Ma Shanyi，Sun Zhaolou.

Department of Oncology， Xuancheng Central Hospital in Anhui Province(Xuancheng 242000)

Objective：To study the effect of NVP-BEZ235 on proliferation of human colon cancer cell line SW480 and its mechanism. Methods：The human colon cancer cell line SW480 were treated with different concentrations of NVP-BEZ235. Proliferation，apoptosis and mechanism of SW480 cells were detected by MTT assay，cells cycle and western blot. Results：NVP-BEZ235 significantly inhibited the growth of SW480 cells and promote the apoptosis of SW480 cells in a time-dependent and dose-dependent manner. Western Blot experiments showed that NVP-BEZ235 could effectively inhibit p-Akt、p-p70S6K protein expression of SW480 cells. Conclusion：NVP-BEZ235 can inhibited SW480 cells proliferation and induce apoptosis. The mechanism may be related to down-regulated of p-Akt、p-p70S6K protein expression.

Colorectal neoplasms Cell enlargement Apoptosis @NVP-BEZ235

結直腸腫瘤 細胞增長 細胞凋亡 @NVP-BEZ235

R735.37

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.013