丹參酮ⅡA預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究

馬春香，孫 媛，陳曉斌 ，張 蕾

1.陜西省人民醫(yī)院(西安710068)，2.西安急救中心(西安 710018)，3.陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安 710003)

△通訊作者

丹參酮ⅡA預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究

馬春香1，2，孫 媛1，陳曉斌1，張 蕾3△

1.陜西省人民醫(yī)院(西安710068)，2.西安急救中心(西安 710018)，3.陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安 710003)

目的：觀察丹參酮ⅡA(TanⅡA)預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷后線粒體通透性的影響。方法：使用SD大鼠，在TanⅡA預(yù)處理5 d后進(jìn)行心肌缺血/再灌注損傷造模并檢測(cè)心肌梗死面積、肌鈣蛋白表達(dá)，使用酶聯(lián)免疫吸附法觀察線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)開放性以及細(xì)胞色素C釋放情況。結(jié)果：TanⅡA預(yù)處理能夠減輕心肌梗死面積、減少肌鈣蛋白表達(dá)；抑制MPTP開放以及細(xì)胞色素C釋放。結(jié)論：TanⅡA預(yù)處理能夠通過抑制MPTP、減少心肌細(xì)胞凋亡發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

丹參酮是丹參的有效成分，其中丹參酮ⅡA(TanⅡA)含量最高。TanⅡA被廣泛用于心腦血管疾病的治療；但是其作用機(jī)制尚未完全闡明[1]。線粒體是細(xì)胞能量主要來源，其功能損傷導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)開放，引起線粒體膜電位異常、呼吸鏈中斷、ATP生成障礙并引起細(xì)胞凋亡，從而最終導(dǎo)致缺血再灌注損傷；也是預(yù)處理等許多心肌保護(hù)措施的重要作用靶點(diǎn)[2]。因此本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型，從MPTP開放角度探討丹參酮ⅡA預(yù)處理對(duì)心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制。

材料與方法

1 材 料 ①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雄性SD大鼠，清潔級(jí)，共48只；周齡8～12周，重量180～220 g，由西安交通大學(xué)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組(S組)、缺血再灌注(I/R組)、TanⅡA治療組(A組)，每組16只。②主要試劑：血漿cTnI檢測(cè)試劑盒、大鼠細(xì)胞色素C氧化酶ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)，線粒體提取試劑盒(南通碧云天生物公司)，伊文式藍(lán)、氯化三苯四氮唑(TTC)(美國Sigma公司)，純化線粒體MPTP檢測(cè)試劑盒(美國Pierce公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法 ①心肌缺血再灌注模型制作：動(dòng)物稱重后用3%苯巴比妥腹腔注射進(jìn)行麻醉，使用小動(dòng)物經(jīng)鼻呼吸面罩輔助呼吸；常規(guī)開胸、逐層分離胸膜、心包，于左心耳下緣、肺動(dòng)脈圓錐水平縱軸上使用尼龍絲線穿圓形塑料套管結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支；以結(jié)扎部位心肌變白、活動(dòng)減弱以及心電圖出現(xiàn)ST段抬高為缺血成功。結(jié)扎30 min后，解開絲線恢復(fù)再灌180 min，以結(jié)扎線下心肌顏色變紅、心電圖ST段下降二分之一為再灌成功。②動(dòng)物模型分組以及給藥方法：S組開胸后僅左前降支下穿線、套管不做結(jié)扎；210 min后取材；I/R組于術(shù)前5 d連續(xù)灌胃給予生理鹽水，1次/d；A組術(shù)前5 d連續(xù)灌胃20 mg/kg TanⅡA，1次/d，第5天給藥1 h。除S組動(dòng)物外，所有動(dòng)物建立心肌缺血再灌注模型。③伊文藍(lán)與TTC雙染法測(cè)定心肌梗死面積：灌注180 min后，頸動(dòng)脈取血后經(jīng)頸靜脈快速推注2 ml 伊文氏藍(lán)(濃度為2%)，迅速摘取心肌，于縱軸垂直方向由心底向心間將左心室等距離切為6片，厚約2 mm/片；隨后將切片置于37 ℃ 水浴下的1%TTC中避光孵育15 min；取出切片以4%甲醛溶液固定1 h并拍照。其中正常心肌染色為藍(lán)色，缺血區(qū)域心肌組織為磚紅色，而梗死心肌組織為白色；所有切片拍照后使用Photoshop CS 5.0計(jì)算各區(qū)域面積，其中紅白藍(lán)面積和為左心室總面積，紅白面積為缺血區(qū)面積；白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ烂娣e。計(jì)算公式如下：缺血區(qū)面積(%)=缺血區(qū)總面積/左心室區(qū)面積×100%，心肌梗死面積(%)=梗死區(qū)面積/缺血區(qū)總面積×100%。④心肌肌鈣蛋白I(cTnI)測(cè)定：左頸動(dòng)脈血1 ml離心15 min后分離取上清，使用ELISA法完成檢測(cè)。⑤MPTP以及細(xì)胞色素C測(cè)定：再灌結(jié)束后取出新鮮心肌于生理鹽水中清洗，分離左心室并研磨、提取新鮮線粒體；采用分光光度法參照MPTP比色法檢測(cè)試劑盒檢測(cè)MPTP開放程度；按照說明書步驟采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞色素C水平。

結(jié) 果

三組心肌缺血、梗死面積以及cTnI、MPTP開放性、細(xì)胞色素C釋放測(cè)定結(jié)果：見表1。S組未見心肌缺血及梗死。與S組相比，I/R組血cTnI表達(dá)水平、MPTP吸光度比值(A440)、細(xì)胞色素C釋放數(shù)值明顯升高(P<0.05)；而A組心肌梗死、缺血面積以及血cTnI表達(dá)水平、MPTP吸光度比值(A440)、細(xì)胞色素C釋放數(shù)值均低于I/R組(P<0.05)。

表1 三組心肌缺血、梗死面積以及cTnI、MPTP開放性、細(xì)胞色素C釋放測(cè)定結(jié)果

注：與S相比，*P<0.05；與I/R組相比，△P<0.05

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)5 d的TanⅡA預(yù)處理能夠通過抑制線粒體通透性、減少cTnI生成，減少細(xì)胞色素C釋放，從而減少缺血再灌注損傷損傷，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。缺血性心臟病已經(jīng)成為包括我國在內(nèi)的全世界最主要死亡原因之一[3]。心肌缺血后再灌恢復(fù)可以減少心肌的壞死并改善心功能，但是再灌往往能引起心肌細(xì)胞的進(jìn)一步損傷甚至死亡，從而使心肌梗死面積增加，導(dǎo)致缺血/再灌注損傷。丹參作為我國傳統(tǒng)活血化瘀的中藥，被廣泛用于心血管疾病的治療；但是其作用機(jī)理尚未闡明。TanⅡA是丹參的有效成分之一，已經(jīng)被大量研究證明具有調(diào)節(jié)血脂、抗血栓、延緩動(dòng)脈粥樣硬化等作用，也被用于心梗、卒中等血管疾病的臨床治療[4-5]。除了在心肌梗死后發(fā)揮治療作用以外，TanⅡA預(yù)處理也同樣能夠發(fā)揮心肌保護(hù)作用[6]。

已有研究發(fā)現(xiàn)，TanⅡA可以通過絲裂原活化蛋白激酶MAPK以及Ras-PI3K/Akt信號(hào)通路上調(diào)一氧化氮(NO)釋放并減少活性氧(ROS)生成，從而發(fā)揮抗氧化、抗炎以及抗凋亡作用并減輕心肌缺血再灌注損傷；但是其作用機(jī)制并未完全明確[7]。位于線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)換孔過度開放導(dǎo)致線粒體通透性異常，與心肌缺血/再灌注損傷密切相關(guān)。細(xì)胞內(nèi)事件如氧化應(yīng)激、離子失衡等都會(huì)引起線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的開放，而且其開放程度與外界刺激程度相關(guān)并決定了對(duì)線粒體功能的影響：當(dāng)心肌細(xì)胞受到嚴(yán)重的刺激事件如缺血再灌注時(shí)，MPTP會(huì)持續(xù)、不可逆的開放，導(dǎo)致線粒體去極化、大量離子進(jìn)入；使線粒體內(nèi)外離子失衡，基質(zhì)水腫、外膜破裂，細(xì)胞色素C被大量釋放至細(xì)胞質(zhì)中，激活線粒體依賴的凋亡信號(hào)、介導(dǎo)細(xì)胞死亡。因此，調(diào)節(jié)MPTP開放能夠有效維持線粒體功能，進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心肌保護(hù)作用[8]。以往研究發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)處理、吸入麻醉藥如異氟烷等預(yù)處理等都能夠減少M(fèi)PTP開放，抑制線粒體通透性，從而減少細(xì)胞色素C釋放、抑制凋亡信號(hào)通路，發(fā)揮心肌保護(hù)作用[9]。而在本實(shí)驗(yàn)中，TanⅡA預(yù)處理同樣抑制了缺血再灌注所致MPTP的過度開放，從而保護(hù)了線粒體膜的完整性并減少了細(xì)胞色素C的釋放，減輕了心肌梗死程度。

綜上所述，MPTP過度開放在心肌缺血/再灌注損傷過程中發(fā)揮著促凋亡的作用；而TanⅡA預(yù)處理可以通過抑制MPTP過度開放、減少細(xì)胞色素C釋放從而減輕心肌細(xì)胞凋亡，實(shí)現(xiàn)心肌保護(hù)作用，為使用TanⅡA預(yù)防心肌梗死提供了部分理論依據(jù)。但是TanⅡA調(diào)節(jié)MPTP的上游機(jī)制以及是否通過其他信號(hào)通路發(fā)揮心肌保護(hù)作用還需要深入研究。

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(收稿：2017-04-10)

心肌缺血 心肌再灌注損傷 丹參酮ⅡA 缺血預(yù)處理，心肌

R541.4

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.014