缺血預(yù)處理和缺血后處理對(duì)腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究*

種 莉,陳 麗,張李娜,唐 鵬,劉 玥

陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)三科(西安710068)

缺血預(yù)處理和缺血后處理對(duì)腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究*

種 莉,陳 麗,張李娜,唐 鵬,劉 玥

陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)三科(西安710068)

目的：比較缺血預(yù)處理和缺血后處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注時(shí)神經(jīng)功能缺損及MMP-9表達(dá)的影響。方法：SD大鼠隨機(jī)分為四組，分別是假手術(shù)組(S組)，缺血再灌注組(I/R組)，缺血預(yù)處理組(IPC組)和缺血后處理組(IPost組)，觀察各組神經(jīng)行為學(xué)，測(cè)定腦組織含水量、TTC染色觀察腦梗死體積，免疫組化染色測(cè)定腦組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達(dá)。結(jié)果：與S組相比，I/R組大鼠的神經(jīng)功能損害評(píng)分明顯升高，腦組織出現(xiàn)大面積梗死，且腦組織含水量明顯增加，MMP-9的表達(dá)升高；而IPC組及IPost組大鼠的經(jīng)功能損害較I/R組有明顯改善，且腦組織梗死面積減小，腦組織含水量降低，MMP-9的表達(dá)強(qiáng)度降低。結(jié)論：缺血預(yù)處理及缺血后處理均能降低大鼠腦缺血再灌注大腦損傷，改善大鼠的神經(jīng)行為學(xué)。

腦血管疾病是目前人類疾病三大死亡原因之一，在我國(guó),腦血管病已上升為首位死亡原因[1],并且存活者會(huì)遺留癱瘓、失語(yǔ)、認(rèn)知障礙等嚴(yán)重殘疾[2]。缺血性腦血管病是最常見(jiàn)的腦血管疾病,最有效的治療措施是早期溶栓,但溶栓后再灌注引起的再灌注損傷、腦水腫等嚴(yán)重并發(fā)癥限制著溶栓治療的推廣應(yīng)用。探尋防治腦缺血-再灌注損傷的策略是缺血再灌注研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。近年來(lái),出現(xiàn)了一系列預(yù)防與治療腦缺血-再灌注損傷的方法,包括缺血預(yù)處理(IPC)、缺血后處理(IPost)、藥物預(yù)處理等。缺血預(yù)處理能有效的改善缺血-再灌注損傷,但其在臨床中的可操作性卻低于缺血后處理，本研究通過(guò)建立大鼠局灶性腦缺血模型，擬比較缺血預(yù)處理和缺血后處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注時(shí)血-腦屏障(BBB)通透性及MMP-9的影響，旨在探討兩種干預(yù)措施腦保護(hù)效應(yīng)的機(jī)制,為缺血后處理在臨床中應(yīng)用提供新的思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材 料 SD大鼠由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，兔抗MMP-9單克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。SP廣譜超敏試劑盒、DAB 酶底物顯色試劑等均購(gòu)于上海生工生物工程有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法 ①腦缺血大鼠模型制備：健康雄性SD大鼠72只，體重280～300 g。動(dòng)物隨機(jī)分為四組,分別是假手術(shù)組(S組),缺血再灌注組(I/R組),缺血預(yù)處理組(IPC組)和缺血后處理組(IPost組)，每組18只。假手術(shù)組：僅手術(shù)暴露、分離頸總、頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈，不予插線阻斷大腦中動(dòng)脈血流，術(shù)后22 h斷頭取腦。I/R組：線栓法阻塞大鼠大腦中動(dòng)脈血流,于栓塞后2 h給予血流再灌注,再灌注后22 h斷頭取腦。IPC組：線栓法阻塞大腦中動(dòng)脈,阻塞5 min后再灌注5 min，重復(fù)3次，恢復(fù)再灌注24 h后再予缺血2 h再灌注22 h后處死。IPost組：線栓法阻塞大腦中動(dòng)脈,阻塞2 h后行缺血后處理，再灌注20 s，而后再阻塞20 s,重復(fù)3次,其后實(shí)現(xiàn)完全再灌注,22 h后斷頭取腦。②神經(jīng)功能缺損評(píng)分：大鼠再灌注22 h后參照改良Bederson評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分[3]。③氯化三苯基四氮唑(TTC)染色和梗死體積計(jì)算：每組取6只大鼠,斷頭取腦,迅速置于-20 ℃冰箱中速凍10 min左右。放入鼠腦槽中,去除嗅球,小腦和低位腦干。從額極向后作冠狀切片，切成5～6片，每片厚2 mm。將切片置于2%TTC溶液中，37 ℃溫箱避光染色30 min。玫紅色為正常腦組織，白色為梗死腦組織。蒸餾水沖洗后4%多聚甲醛固定,24 h后數(shù)碼相機(jī)照相。利用圖像處理軟件Image-Pro Plus 6.0計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，算出各個(gè)腦片梗死區(qū)域的體積和缺血側(cè)的總體積,求出梗死體積占大腦半球總體積的百分比。④腦含水量測(cè)定：每組取6只大鼠，斷頭取腦,將大腦半球左右分開(kāi)，缺血側(cè)半球組織稱濕重后，置110 ℃電烤箱烘烤24 h，再迅速測(cè)干重。腦組織水含量=[(濕重-干重)/濕重]×100%。⑤MMP-9免疫組化染色：每組取6只大鼠，用水合氯醛深度麻醉動(dòng)物后心臟灌注生理鹽水和4%多聚甲醛各約200 ml，斷頭取腦，切取視交叉前緣至垂體后緣組織塊，4%多聚甲醛溶液固定后脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，然后置于經(jīng)明膠處理的干凈載玻片上，烤片12 h后進(jìn)行染色。免疫組化SP法及DAB顯色操作步驟均嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

結(jié) 果

1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 S組大鼠沒(méi)有神經(jīng)功能缺損,評(píng)分為0。I/R組神經(jīng)功能缺損評(píng)分(3.40±0.55)分,顯著高于S組(P<0.05)。IPC組及IPost組評(píng)分分別為(2.00±0.71)分及(1.8±0.45)分,組間比較顯示IPC組及IPost組的神經(jīng)功能損傷評(píng)分雖高于S組,但與I/R組相比,評(píng)分明顯降低(P<0.05)。

2 TTC染色和梗死體積計(jì)算 TTC染色結(jié)果顯示，S組大鼠腦組織無(wú)梗死，I/R組大鼠腦組織出現(xiàn)明顯的梗死灶，梗死體積占全腦總體積的(35.12±6.65)%，IPC組及IPost組的梗死體積占全腦總體積的(15.60±2.89)%及(11.38±1.11)%，較I/R組相比明顯減小(P<0.05),見(jiàn)圖1。

A：S組；B：I/ R組；C：IPC組；D：IPost組

3 腦組織含水量測(cè)定 S組大鼠的腦組織含水量為(76.49±1.72)%，而I/R組大鼠腦組織的含水量同S組相比，明顯增加，達(dá)(83.57±1.13)%(P<0.05)；IPC組及IPost組大鼠腦組織的含水量分別為(81.14±0.85)%及(81.29 ± 0.80)%，與I/R組相比,均有不同程度的降低(P<0.05)。

4 MMP-9免疫組化染色 S組MMP-9表達(dá)呈陰性，而I/R組大鼠腦組織MMP-9表達(dá)明顯升高，陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)達(dá)(25.28±3.13)個(gè)/視野；IPC組及IPost組大鼠腦組織MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為(20.14±2.85)個(gè)/視野及(21.29±2.90)個(gè)/視野，表達(dá)強(qiáng)度雖較S組有所升高，但明顯低于I/R組(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

A：S組；B：I/ R組；C：IPC組；D：IPost組

討 論

治療腦缺血的前提和基礎(chǔ)是迅速恢復(fù)缺血腦組織的血流灌注，但再灌注過(guò)程中會(huì)繼發(fā)腦水腫等多種腦組織損傷，這也是病情加重的一個(gè)重要因素。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，得益于血-腦屏障(BBB)的存在。正常狀態(tài)下，除了氣體及脂溶性小分子，其他大分子物質(zhì)難以通過(guò)BBB。而急性腦缺血后,BBB破壞,通透性增加，水和血漿成分漏出到周圍腦組織，形成腦水腫，同時(shí)大量炎性因子釋放和炎性細(xì)胞滲出，加劇炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[4]，加重腦組織缺血再灌注損傷。

毛細(xì)血管基底膜(BM)是維持BBB完整性的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)構(gòu)成BM的支架，急性腦梗死后多種蛋白水解酶活性上升，其中基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)幾乎能降解除多糖外ECM的所有成分，在腦水腫的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。MMPs家族中以MMP-9對(duì)BBB通透性的變化影響最大[5]。腦缺血后MMP-9激活的一個(gè)早期的病理作用就是促進(jìn)血管源性腦水腫形成[6]。其可能的機(jī)理為急性腦缺血時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MMP-9，增高的MMP-9可破壞基底膜和BBB內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接而導(dǎo)致BBB受損，通透性增加，產(chǎn)生腦水腫，使病情迅速惡化[7]。研究證實(shí)，MMP-9亦會(huì)加重腦缺血后炎性反應(yīng)的損傷，腦缺血后中性粒細(xì)胞等可分泌MMP-9，后者又進(jìn)一步促進(jìn)白細(xì)胞浸潤(rùn)，并且破壞BBB，造成腦內(nèi)微血管的二次損傷，導(dǎo)致神經(jīng)元壞死[5]。因此,BBB通透性的改變以及血管源性水腫的發(fā)生和發(fā)展可以通過(guò)監(jiān)測(cè)MMP-9水平的變化來(lái)預(yù)測(cè)。

缺血預(yù)處理是一種已被公認(rèn)的有效的抗缺血-再灌注損傷措施，指臟器在經(jīng)受多次短暫缺血和再灌注后，能耐受隨后長(zhǎng)時(shí)間的缺血-再灌注損傷。大量研究證實(shí)，這一現(xiàn)象存在于不同種屬的不同組織器官中[8]，包括腦組織。缺血預(yù)處理可誘導(dǎo)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，抵御其后發(fā)生的較嚴(yán)重的甚至致死性腦缺血事件。而缺血后處理，即在缺血后給予幾個(gè)短暫的灌注/再缺血循環(huán)的處理措施。后處理對(duì)心肌等組織再灌注損傷的保護(hù)作用也在一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究中得到證實(shí)[9]。目前缺血后處理對(duì)腦缺血-再灌注損傷的作用也引起了學(xué)者們的重視。

本研究顯示,缺血再灌注后大鼠出現(xiàn)不同程度神經(jīng)行為學(xué)異常，腦組織有明顯的梗死灶，腦組織的含水量顯著增加，MMP-9的表達(dá)升高,而經(jīng)過(guò)缺血預(yù)處理及缺血后處理后,神經(jīng)功能缺損評(píng)分、梗死灶體積、腦組織含水量及MMP-9表達(dá)雖高于假手術(shù)對(duì)照組,但與缺血再灌注組大鼠相比,則顯著降低,提示缺血預(yù)處理及缺血后處理均可以在一定程度上減輕腦水腫,降低缺血再灌注對(duì)大鼠神經(jīng)的損傷。

臨床上腦缺血的發(fā)生通常是不可知的,而預(yù)處理必須在缺血前實(shí)施,因此在臨床上無(wú)法掌握缺血預(yù)處理的時(shí)機(jī)，故其臨床應(yīng)用受到了很大限制。也有研究認(rèn)為缺血預(yù)處理具有減輕腦組織損傷的作用,但對(duì)于改善遠(yuǎn)期神經(jīng)功能缺損意義不大[10]。如上所述，針對(duì)已缺血的腦組織采取更為合理的處理措施以減輕再灌注的近期和遠(yuǎn)期損傷，無(wú)疑具有更重要的臨床價(jià)值。在急性缺血后給予缺血后處理,可以激發(fā)機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制,可操作性大,并且已在部分臨床研究中證實(shí)其保護(hù)效果確切,因此缺血后處理具有更好的臨床應(yīng)用前景和實(shí)用價(jià)值。

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Effectsofischemicpreconditioningversusischemicpostconditioningonischemia-reperfusioninjury

Chong Li,Chen Li,Zhang Lina,et al.

Department of Neurology,Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an 710068)

Objective: To Compare the influence of the neuroethology and the expression of MMP-9 after ischemic preconditioning and ischemic postconditioning on ischemia-reperfusion in rats. Methods: SD rats were randomly divided into four groups: control group (S), ischemia reperfusion group (I/R group), ischemic preconditioning (IPC) and ischemic postconditioning group (IPost), to Observe the neuroethology, the ischemia scope by TTC staining, the expression of MMP-9 by Immunohistochemical staining. Results: Compared with the S group, neurologic impairment scores in I/R group were increased significantly, large area of infarction was detected,the brain water content increased obviously,and the expression of MMP-9 was higher. Compared with the I/R group, neurologic impairment scores in IPC and IPost group were lower,inftact volume decreased, the brain water content decreased,and the expression of MMP- 9 was lower. Conclusion: Ischemic preconditioning and ischemic postconditioning can reduce the damage of brain ischemia reperfusion and improve neural function in rats.

Brain ischemia Ischemic preconditioning Ischemic postconditioning Reperfusion injury

*陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2012JM4003)

腦缺血 缺血預(yù)處理 缺血后處理 再灌注損傷

R743.32

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.015

(收稿：2017-01-03)