胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白在肺氣腫患者肺組織中的表達(dá)*

豆亞偉，王宏濤，田 偉，朱建飛，戴 云，羅向暉，陳耀華

陜西省人民醫(yī)院(西安710068)

胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白在肺氣腫患者肺組織中的表達(dá)*

豆亞偉，王宏濤，田 偉，朱建飛，戴 云，羅向暉，陳耀華

陜西省人民醫(yī)院(西安710068)

目的：研究胰島素治療對慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肺組織的作用機(jī)制。方法：擇期行肺減容手術(shù)患者99例，術(shù)前2周開始即給予極化液(含胰島素液)治療。術(shù)中取肺減容切除肺組織，Western blot 印跡法檢測肺組織蛋白激酶B(Akt)、p38絲裂原活化蛋白激酶(P38-MAPK)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)表達(dá)的變化。結(jié)果：胰島素治療后肺氣腫患者肺組織內(nèi)磷酸化蛋白激酶B(pAkt)表達(dá)水平較其對照組增加(P<0.05)。胰島素治療后肺氣腫患者肺組織內(nèi)P38-MAPK表達(dá)與其對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。胰島素治療后肺氣腫患者肺組織內(nèi)NF-κB表達(dá)較其對照組增加(P<0.05)。結(jié)論：胰島素可能通過在COPD患者的肺組織中激活PI3/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并激活其下游的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 抑制多種刺激所誘發(fā)的細(xì)胞凋亡。

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以進(jìn)行性不完全可逆的氣道呼吸氣流受限為特征的疾病，有較高的病死率和致殘率，在人群中發(fā)病率極高[1-2]。肺泡壁細(xì)胞凋亡是肺氣腫發(fā)病機(jī)制的一個重要環(huán)節(jié)。而既往研究已證明胰島素治療可明顯降低危重癥患者在臨床上出現(xiàn)的相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生率與病死率，并能改善患者的預(yù)后，但其中的相關(guān)作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。本研究從肺氣腫患者術(shù)前2周開始即給予極化液(含胰島素液)，觀察胰島素治療對COPD患者肺組織的作用機(jī)制。

資料與方法

1 一般資料 選擇2013年1月至2016年12月收住本院胸外科并擇期行肺減容手術(shù)的患者99例，男57例，女42例。99例患者隨機(jī)分為兩組，胰島素治療組(IT組)52例，常規(guī)治療組(RT組)47例。IT組男30例，女22例，平均年齡(56.12±13.71)歲，平均體重(70.18±15.38)kg；RT組男27例，女20例，平均年齡(59.28±11.35)歲，平均體重(65.89±12.76)kg。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前存在肝腎疾病及其功能不全者；術(shù)前凝血功能異常者；二次手術(shù)者；既往有糖尿病史者。

2 研究方法 ①胰島素治療：用普通胰島素20 U和10%氯化鉀15 ml加入10%葡萄糖液500 ml和50%葡萄糖60 ml配制極化液，術(shù)前2周開始給予IT組患者靜脈滴注，1次/d，直至手術(shù)前1天結(jié)束輸注。②肺組織蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(pAkt)、p38絲裂原活化蛋白激酶(P38-MAPK)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的 Western blot 印跡法檢測：于術(shù)中取肺減容切除的肺組織約2 g，用0.9%生理鹽水洗凈血液，立即置入液氮中備用。標(biāo)本收集完備后，用Heidolph DIA900組織勻漿器將其勻漿，離心(14 000 g，15 min)后提取其中的組織蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒(Pierce)定量蛋白濃度。SDS/PGEA電泳分離蛋白，半干電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF。5%脫脂乳封閉背景，以抗pAkt、抗pP38-MAPK、NF-κB、p65抗體4 ℃過夜，洗膜后以相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，免疫檢測試劑盒進(jìn)行熒光檢測。再將pAkt或pP38-MAPK印跡膜50 ℃，30 min復(fù)印跡，置于洗脫緩沖液中進(jìn)行原來的一抗解離，用PBST漂洗并重新封閉印跡膜行Akt、P38-MAPK的檢測。

結(jié) 果

肺組織Akt、pAkt、P38-MAPK、NF-κB表達(dá)的變化：見表1。 ①胰島素治療后肺氣腫肺組織內(nèi)Akt表達(dá)與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。②胰島素治療后肺氣腫肺組織內(nèi)pAkt表達(dá)較對照組增加(P<0.05)。表明胰島素可調(diào)節(jié)肺氣腫肺組織內(nèi)中Akt的活化。③胰島素治療后肺氣腫肺組織內(nèi)pP38-MAPK表達(dá)與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。表明胰島素對肺氣腫肺組織中P38-MAPK的活化無明顯的影響。④胰島素治療后肺氣腫肺組織內(nèi)NF-κB表達(dá)較對照組增加(P<0.05)。表明胰島素可上調(diào)肺氣腫肺組織中NF-κB的表達(dá)。

表1 兩組肺組織Akt、P38-MAPK、P38-MAPK、NF-κB表達(dá)的變化(灰度值)

討 論

既往研究已證明，胰島素與其靶細(xì)胞膜胰島素受體結(jié)合后啟動并發(fā)揮它的作用，而胰島素受體后信號是通過其中的兩條主要的轉(zhuǎn)導(dǎo)通道完成的[3]：一條是Ras-絲裂原激活蛋白(MAPK)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；另一條是磷酸肌醇-3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt/PKB)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[4]，該轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)了胰島素的大部分生物學(xué)效應(yīng)，能夠調(diào)節(jié)葡萄糖的攝取、促進(jìn)細(xì)胞分裂、增生及生存、抗凋亡、激活多個基因的表達(dá)等。

本研究中發(fā)現(xiàn)胰島素治療后肺氣腫患者肺組織內(nèi)pAkt表達(dá)較對照組增加(P<0.05)。這表明胰島素調(diào)節(jié)了肺氣腫肺組織內(nèi)Akt的活化。而Akt的活化是胰島素誘導(dǎo)的抗凋亡及促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞生存作用中的關(guān)鍵步驟，這就提示胰島素在肺組織內(nèi)通過激活PI3/Akt轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮其抗凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，從而延緩或改善了肺氣腫的形成與發(fā)展。另外，本研究中胰島素治療后肺氣腫患者肺組織內(nèi)NF-κB表達(dá)較對照組增加(P<0.05)，表明胰島素可上調(diào)肺氣腫肺組織內(nèi)NF-κB的表達(dá)。而PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路可活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB[5]，其進(jìn)入細(xì)胞核后，可促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。同時NF-κ B活化ATM/ATR、DNA-PK，促進(jìn)細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)[6]。這一結(jié)果提示胰島素在肺組織內(nèi)通過活化NF-κB發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)等作用，而這些可以促進(jìn)肺組織細(xì)胞的增殖，從而修復(fù)肺氣腫破壞的肺泡壁等。

胰島素MAPK信號通道由三部分組成，包括：細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、JNK和p38激酶途徑[7]。其中胰島素所激活的ERK信號通路與細(xì)胞生長存在相關(guān)性。另外，胰島素通過Ras-MAPK傳導(dǎo)途徑可以激活p38-MAPK，它能促使靶細(xì)胞的基因表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞的生長，以及促使釋放一些相關(guān)的細(xì)胞因子[8-9]。我們的研究中胰島素治療后肺氣腫患者肺組織內(nèi)pP38-MAPK表達(dá)與對照組相比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。這可以表明胰島素對于肺氣腫肺組織內(nèi)P38-MAPK的活化無明顯的影響。

總之，胰島素可能通過在COPD患者的肺組織中激活磷酸肌醇-3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt/PKB)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并激活下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB來抑制多種刺激所可能誘發(fā)的肺組織內(nèi)細(xì)胞凋亡。而PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路在COPD的形成和治療中所可能扮演重要角色，這些還有待進(jìn)一步的研究。

[1] 王 媛，張華麗，張 勇，等.COPD急性加重期患者血清SAA、PCT、hs-CRP水平變化及意義[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2015，44(5)：616-617.

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Expressionofinsulinsignaltransductionpathwayassociatedproteininlungtissueofemphysema

Dou Yawei，Wang Hongtao，Tian Wei，et al.

Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an 710068)

Objective：To study the mechanism of insulin therapy on lung tissue in COPD patients. Methods：Select 99 patients underwent elective lung volume reduction surgery，2 weeks before surgery to give polarized solution (including insulin solution) treatment. The expression of Protein kinase B(Akt)，p38 mitogen-activated protein kinase(P38-MAPK)and nuclear factor-κB(NF-κB)in lung tissue were detected by Western blotting. Results：The expression of Phosphorylated protein kinase B(pAkt) in lung tissue of patients with emphysema after insulin therapy was higher than that in control group (P<0.05).The expression of pP38-MAPK in lung tissue in patients with emphysema after insulin treatment was not significantly different from that in control group (P>0.05). The expression of NF-κB in lung tissue of patients with emphysema after insulin therapy was higher than that in control group (P<0.05). Conclusion：Insulin may inhibit cell apoptosis by stimulating a variety of stimuli by activating the PI3K/Akt signaling pathway and activating its downstream transcription factor NF-κB in lung tissue of COPD patients.

Pulmonary emphysema Insulin Apoptosis Mitogen-activated protein kinase phosphatases NF-kappa B

*陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013JC2-23)

肺氣腫 胰島素 細(xì)胞凋亡 絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶 NF-κB

R562.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.026

(收稿：2017-03-15)