2型糖尿病大鼠膀胱逼尿肌中膜結合型前列腺素E2合酶1的表達及意義

王彥彬 李瑞鵬 諸靖宇 徐侃

2型糖尿病大鼠膀胱逼尿肌中膜結合型前列腺素E2合酶1的表達及意義

王彥彬 李瑞鵬 諸靖宇 徐侃

目的 探討2型糖尿病大鼠膀胱逼尿肌中膜結合型前列腺素E2合酶1（mPGES-1）的表達及意義。方法 將36只雌性SD大鼠隨機分成糖尿病組與對照組，每組18只。使用鏈脲佐菌素（STZ）建立2型糖尿病大鼠動物模型。造模成功后12周，觀察并比較兩組大鼠一般生理體征；在光鏡下觀察膀胱逼尿肌組織HE染色結果，在透射電鏡下觀察組織超微結構變化，采用免疫組化法檢測組織中mPGES-1表達水平，并使用前列腺素E2（PGE2）酶聯免疫試劑盒檢測24h尿液中PGE2含量，所得結果進行組間比較。結果 與對照組比較，糖尿病組大鼠終末體重明顯降低（P＜0.05），終末血糖、膀胱濕重和24h尿量均明顯增加（均P＜0.05）。與對照組比較，糖尿病組大鼠在光鏡下可見逼尿肌肌束結構排列紊亂，肌束間隙變寬；在透射電鏡下可見逼尿肌細胞間距變寬，胞質內線粒體腫脹破裂呈空泡狀。糖尿病組大鼠24h尿液PGE2含量、膀胱逼尿肌組織中mPGES-1表達水平較對照組均明顯下降（P＜0.05）。結論 2型糖尿病大鼠膀胱逼尿肌組織中mPGES-1表達水平及尿液PGE2含量均明顯降低，可能與糖尿病性膀胱病的進展有關。

2型糖尿病 膀胱 膜結合型前列腺素E2合酶1 前列腺素E2

糖尿病性膀胱病（diabetic cystopathy，DCP）是一種糖尿病泌尿系統的并發癥，主要是由糖尿病周圍神經病變引起的膀胱功能障礙[1]。有研究發現前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）是一種重要的細胞生長和調節因子，它是逼尿肌收縮的重要控制介質，在排尿反射中扮演著重要角色[2]。目前關于PGE2與DCP的關系研究國內較少，因此筆者通過建立2型糖尿病大鼠模型，應用酶聯免疫吸附法與免疫組化技術檢測PGE2及其同工酶膜結合型前列腺素E2合酶1（mPGES-1）的表達，以探討2型糖尿病大鼠膀胱逼尿肌組織中mPGES-1的表達及意義，為深入研究DCP的發病機制提供線索。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及材料 實驗動物選用SPF級健康雌性SD 大鼠 36只（10周），體重（230.35±21.26）g，購于上海斯萊克[合格證號：SCXK（滬）：2012-002]；所有動物飼養于浙江中醫藥大學實驗動物中心SPF實驗室。鏈脲佐菌素（STZ）由美國Sigma公司生產；枸椽酸鹽購自上海馳為實業有限公司；血糖測定儀、血糖試紙由美國強生公司生產；免疫組化試劑盒購自福州脈新生物技術開發有限公司；大鼠PGE2酶聯免疫試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、造模及一般生理體征觀察 36只SD大鼠禁食12h后，隨機分為糖尿病組與對照組，每組18只。將STZ溶解于pH 4.2、濃度0.1mol/L的枸櫞酸緩沖液中，按50mg/kg劑量予以單次腹腔注射[3]，注射1次/d，注射至第4周確認大鼠空腹血糖均＞11.1mmol/L，即造模成功；對照組予以腹腔注射等劑量的枸櫞酸緩沖液。兩組大鼠繼續予以飼料喂養，于造模成功后第12周（糖尿病組空腹血糖均＞11.1mmol/L）測量兩組大鼠代謝籠24h尿量，并留取所有大鼠24h尿液用于PGE2含量檢測，測定大鼠空腹血糖為終末血糖，測定大鼠體重為終末體重，并按0.3ml/100g劑量予以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥位固定并處死大鼠，完整切除膀胱，排凈殘余尿液后稱取膀胱濕重。

1.2.2 常規HE染色 取膀胱逼尿肌條投入10%中性

甲醛溶液同定，石蠟包埋組織切片，作HE染色。

1.2.3 透射電鏡下觀察超微結構 取大鼠膀胱逼尿肌組織，剪成1mm×1mm×1mm大小的組織塊，常規包埋，超薄切片（120nm），2%醋酸鈾染色及枸櫞酸鉛染色，在透射電鏡（×8 900）下觀察兩組大鼠膀胱逼尿肌超微結構。1.2.4 免疫組化檢測 蠟塊連續切片，厚3μm。采用En vision免疫組化二步法染色，用已知陽性的大鼠膀胱逼尿肌組織作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照，DAB顯色。在光鏡下mPGES-1陽性反應部位為棕黃染色，利用計算機圖像分析軟件（Imagepro-plus 6.0）計算平均吸光度（A值），即大鼠膀胱逼尿肌組織mPGES-1表達水平。

1.2.5 尿液PGE2含量檢測 使用PGE2酶聯免疫試劑盒，測定24h尿液中PGE2含量，實驗步驟嚴格按照試劑盒中說明書進行操作。

1.3 統計學處理 建立Excel數據庫，應用SPSS17.0統計軟件。計量資料用表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠一般生理體征比較 兩組大鼠初始體重比較，差異無統計學意義（PP＞0.05）。與對照組比較，糖尿病組大鼠終末體重明顯減少，終末血糖、膀胱濕重和24h尿量均明顯增加，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 兩組大鼠一般生理體征比較

2.2 兩組大鼠膀胱逼尿肌組織HE染色結果比較 糖尿病組大鼠膀胱逼尿肌組織HE染色結果在光鏡下可見：黏膜下炎細胞浸潤，肌束縱橫交錯，排列紊亂，逼尿肌細胞肥大，形態不規則，見圖1a；對照組可見膀胱肌束纖維整齊排列，逼尿肌細胞大小一致，見圖1b。

2.3 兩組大鼠膀胱逼尿肌超微結構比較 在透射電鏡下，糖尿病組大鼠逼尿肌細胞間距變寬，外形、大小不一致，分布不均勻，排列走行紊亂，有部分凹陷，胞質內線粒體腫脹破裂呈空泡狀，細胞連接纖維化、成纖維細胞變性及膠原纖維排列紊亂，見圖2a；對照組大鼠逼尿肌細胞表面平滑，排列均勻，胞質內有少量線粒體，且結構較完整，見圖2b。

圖1 兩組大鼠膀胱逼尿肌組織HE染色所見比較（a：糖尿病組；b：對照組；×400）

2.4 兩組大鼠尿液PGE2含量及膀胱逼尿肌組織中mPGES-1表達水平比較 與對照組比較，糖尿病組大鼠尿液PGE2含量、膀胱逼尿肌組織中mPGES-1表達水平均明顯下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2和圖3。

圖2 兩組大鼠膀胱逼尿肌超微結構比較（a：糖尿病組，箭頭所示為腫脹線粒體；b：對照組，箭頭所示為正常線粒體；×8 900）

表2 兩組大鼠尿液PGE2含量及膀胱逼尿肌組織中mPGES-1表達水平比較

圖3 兩組大鼠膀胱逼尿肌免疫組化結果比較（a：糖尿病組；b：對照組；En vision免疫組化二步法，×400）

3 討論

近年來糖尿病發病率逐漸升高，且呈年輕化趨勢。而DCP發生率高達40%～85%[4]，主要是由糖尿病神經病變導致自主神經功能障礙引起的。DCP發病初期以排尿次數增多、膀胱順應性增高為特征，隨著病程進展，排尿間隔延長、次數減少，后期逼尿肌收縮功能受損導致排尿無力，最終引起尿潴留、腎功能不全等嚴重并發癥[5]。但目前關于其膀胱功能損害的具體機制尚不清楚，臨床治療缺乏針對性，療效欠佳。參考當前文獻，筆者總結DCP的發病機制，大致可分為以下3個方面：（1）肌源性因素。包括逼尿肌形態改變、逼尿肌細胞萎縮等，最終導致逼尿肌功能喪失[6-7]；（2）血管因素。包括血管供應減少、血管內皮功能障礙、炎癥等，最終影響膀胱功能[8]；（3）神經源性因素。包括神經生長因子（NGF）[9]、胰島素生長因子（IGF-1）[10-11]、PGE2水平下降[12]，內皮型一氧化氮合酶增加[13]等。

PGE2是花生四烯酸的代謝產物，花生四烯酸在環氧酶的作用下生成中間產物PGH2；但PGH2不穩定，隨后可在PGE合酶（PGES）的作用下生成PGE2。目前已發現有3種PGES同工酶，其中最主要的是mPGES-1，它們在不同條件下調控PGE2的合成，發揮著重要的生物學功能[14]。例如在排尿功能方面，PGE2是逼尿肌收縮重要的控制介質，參與膀胱的排尿反射[2]；它也可直接激活膀胱組織中辣椒素敏感性神經纖維即C纖維引起排尿反射[15]。PGE2在胃腸道能通過激活鳥苷酸環化酶促進黏液分泌，保護胃黏膜的完整，防止潰瘍發生；而PGE2能在泌尿系上皮大量合成，故PGE2在維持膀胱黏膜完整性方面也可能發揮著相似的作用。因此，當患者發生糖尿病時，PGE2的合成下降就可能引起尿液對膀胱、尿道黏膜組織的損害。其次，PGE2可以調節膀胱平滑肌肌細胞增生和組織塑形，所以PGE2很可能參與了糖尿病膀胱、尿道平滑肌細胞增生與肥大的適應過程。

糖尿病組大鼠24h尿液中PGE2含量及膀胱逼尿肌組織中mPGES-1表達水平較對照組均明顯降低，與Nirmal等[12]研究結果一致。Nirmal等[12]通過測定糖尿病大鼠尿液中PGE2含量發現，所有大鼠出現膀胱功能障礙，且尿液中PGE2含量明顯下降；可能機制是糖尿病膀胱組織中分子信號通路失調，膀胱組織結構重建，膀胱上皮細胞功能損傷且數量減少，導致分泌PGE2減少，從而加重膀胱功能障礙[13]。而本實驗證實DCP大鼠PGE2合成的關鍵酶mPGES-1表達水平也降低，可能是PGE2含量減少的原因之一。一項對離斷的膀胱逼尿肌的體外研究發現，糖尿病逼尿肌肌條對外源性花生四烯酸的刺激反應被抑制，說明若PGE2下降，則逼尿肌反射強度下降或被抑制[4]，可見PGE2在膀胱逼尿肌收縮功能方面扮演著重要的角色。

綜上所述，2型糖尿病大鼠膀胱逼尿肌組織中mPGES-1表達水平及尿液PGE2含量均明顯降低，可能與DCP的進展有關，但具體的作用機制有待進一步探討。

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Expression of mPGES-1 in bladder of streptozotocin-induced diabetic rats

WANG Yanbin,LI Ruipeng,ZHU Jingyu,et al.

Department of Urology,the Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310009,China

Objective To investigate the expression of membrane-associated prostaglandin synthase 1(mPGES-1)in urinary bladder of streptozotocin(STZ)-induced diabetic rats. Methods Thirty six female SD rats were randomly divided into model and control groups with 18 in each.Diabetic cystopathy(DCP)model was induced by intraperitonieal injection of streptozotocin(STZ).After 12 weeks,the animals were sacrificed and the bladder samples were harvested.The histological changes were observed by light microscopic and electron microscopic examination,and the expression of mPGES-1 in bladder tissue was detected by immunohistochemistry and the contents of PGE2in 24h urine were measured by ELISA method. Results Compared with the control group,diabetic rats showed disorder of detrusor smooth muscle structure and wider muscle gap under light microscope.Electron microscopy showed that intercellular space of detrusor was wider and detrusor cells was irregular in shape,the swelling and rupture of mitochondria,and vacuolization were found in cytoplasm.Compared to control group,the contents of PGE2in the urine and the expression of mPGES-1 in bladder detrusor tissue of DCP group were significantly decreased. Conclusion The down-regulated expression of mPGES-1 may play an important role in the occurrence and development of diabetic cystopathy in rats.

Type 2 diabets Bladder mPGES-1 Prostaglandin E2

2016-07-15）

（本文編輯：陳丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.18.2016-1085

浙江省醫學會臨床科研基金項目（2013ZYC-A41）；杭州市醫學重點學科基金資助項目（2014-13-65、2017-51-84）

310009 浙江中醫藥大學附屬杭州第三醫院（杭州市第三人民醫院）泌尿外科（王彥彬、李瑞鵬、諸靖宇），外科（徐侃）

徐侃，E-mail：hzxk.zj@163.com