蛋白激酶D1及其磷酸化位點在皮膚鱗狀細胞癌、Bowen病及光線性角化病組織中的表達

顧靜 劉保國 周萌 苗國英 呂超 柴小磊

067000河北，承德醫(yī)學院研究生學院（顧靜、周萌）；河北工程大學附屬醫(yī)院皮膚科（劉保國、苗國英、呂超），輸血科（柴小磊）

蛋白激酶D1及其磷酸化位點在皮膚鱗狀細胞癌、Bowen病及光線性角化病組織中的表達

顧靜 劉保國 周萌 苗國英 呂超 柴小磊

067000河北，承德醫(yī)學院研究生學院（顧靜、周萌）；河北工程大學附屬醫(yī)院皮膚科（劉保國、苗國英、呂超），輸血科（柴小磊）

目的探討蛋白激酶D1（PKD1）及其磷酸化位點pPKD1?tyr463和pPKD1?ser916在鱗狀細胞癌（SCC）、Bowen病和光線性角化病（AK）中的表達及意義。方法收集新鮮SCC、Bowen病、AK及正常皮膚組織各10份，RT?PCR法檢測各組樣本中PKD1在基因水平的表達，Western印跡法檢測各組樣本中PKD1及其磷酸化位點在蛋白水平的表達。另收集蠟塊組織SCC 50份、Bowen病20份、AK 20份及正常表皮組織10份，免疫組化檢測PKD1、pPKD1?tyr463及pPKD1?ser916的表達情況。結(jié)果正常皮膚組織、SCC、Bowen病和AK組織中PRKD1 mRNA的表達量分別為0.64± 0.09、5.37±1.06、2.69±0.72和2.43±0.46，4組間差異有統(tǒng)計學意義（F=21.37，P＜0.05），且SCC、Bowen病和AK組織的表達水平均顯著高于正常組織（P＜0.05），SCC組織又顯著高于AK和Bowen病組織（均P＜0.05），而Bowen病與AK組織的表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。PKD1總蛋白及pPKD1?tyr463在SCC和Bowen病組織中主要表達在棘層細胞及異形細胞的細胞質(zhì)和細胞膜，且陽性表達率均顯著高于正常皮膚組和AK組（均P＜0.01）；pPKD1?ser916僅在部分高分化SCC癌巢中少量表達，而低分化鱗癌、AK、Bowen病及正常皮膚組織中均未見表達；SCC組中PKD1陽性表達率隨鱗癌病理分級的提高而增加，且PKD1與pPKD1?tyr463的表達呈正相關(guān)（rcc=0.479，P＜0.05）。Western印跡檢測結(jié)果與免疫組化檢測結(jié)果大致相符。結(jié)論PKD1及其磷酸化位點Tyr463可能參與復層鱗狀上皮來源的皮膚腫瘤的形成和進一步發(fā)展分化，在皮膚SCC形成進程中PKD1可能通過Tyr463位點活化而發(fā)揮促進作用。

癌，鱗狀細胞；Bowen病；角化病，光化性；蛋白激酶D1

蛋白激酶D（PKD）是一種新發(fā)現(xiàn)的鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶［1］，有3個家族成員，其中PKD1廣泛表達于各組織和器官中，參與調(diào)控細胞內(nèi)多條信號傳導通路，在調(diào)節(jié)一系列細胞生物學行為、維持細胞功能方面發(fā)揮十分重要的作用［2?3］。PKD1基因（PRKD1）位于人類染色體14qll位置，已被證實在多種腫瘤組織中異常表達［4?6］，對表皮角質(zhì)形成細胞的增殖和分化具有重要影響，可能參與表皮腫瘤的形成，其Ser916位點的磷酸化被認為是衡量PKD1激酶活性的關(guān)鍵指標。有研究表明，皮膚黑素瘤細胞中PKD1可能以此途徑活化［7］。在氧化應激等條件下酪氨酸激酶的活性增強，使PKD1的Tyr463位點發(fā)生磷酸化，結(jié)合目前的研究，我們認為在皮膚非黑素瘤中PKD1可能通過該途徑活化［8］。本文從基因和蛋白水平檢測PKD1及其兩個磷酸化位點pPKD1?tyr463和pPKD1?ser916在皮膚鱗狀細胞癌（SCC）、Bowen病、光線性角化病（AK）及正常表皮組織中的表達，探討PKD1在皮膚鱗狀細胞癌逐步形成和發(fā)展中發(fā)揮的作用和意義。

材料與方法

一、材料與試劑

用于RT?PCR和Western印跡檢測的SCC、Bowen病、AK及正常皮膚組織標本各10份，均選自河北工程大學附屬醫(yī)院皮膚外科2015年12月至2016年5月手術(shù)切除的組織，標本離體后立即液氮處理，超低溫冰箱保存待檢。用于免疫組化檢測的石蠟包埋組織標本選自本院皮膚科2010年1月至2015年12月行病理檢查而確診，且臨床和病理資料均完整的患者，包括SCC 50例、Bowen病20例、AK 20例。50例SCC按照Border分級法分為高分化SCC（Ⅰ級）31例、中分化SCC（Ⅱ級）12例、低分化SCC（Ⅲ～Ⅳ級）7例。收集本院美容整形外科手術(shù)切除的無任何皮膚疾病或外傷瘢痕的正常皮膚組織10例，制成石蠟標本作為對照，PKD1總蛋白的陽性對照來自病理科已確診的乳腺癌組織蠟塊。

總RNA提取試劑RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒、引物及內(nèi)參均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品，濃縮型兔抗人PKD1/PKC mu多克隆抗體、兔抗人PKD1/PKC mu（phosphoY463，pPKD1?tyr463）多克隆抗體、兔抗人PKD1/PKC mu（phospho S916，pPKD1?ser916）單克隆抗體為美國Abcam公司產(chǎn)品，PV6001免疫組化染色試劑盒及DAB顯色劑為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，總蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，其余試劑均由河北工程大學醫(yī)學院中心實驗室提供。

二、RT?PCR法檢測各組樣本中PKD1在基因水平的表達

凍存組織置于預冷的研缽中加入液氮研磨至粉末狀，依照總RNA提取試劑說明書提取RNA。核酸蛋白檢測儀檢測RNA純度（A260/A280范圍為1.7～2.1），按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求的條件合成cDNA，所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物采用ABI 7500型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）擴增，引物及內(nèi)參合成于寶生物工程（大連）有限公司。PRKD1引物上游5′?AATGCAGC TTTCATGTATCCACCA?3′，下游5′?GCATTCCAGCT CTCGCAAATCTA?3′，產(chǎn)物177 bp；內(nèi)參GAPDH引物上游5′?AGAAGGCTGGGGCTCATTTG?3′，下游5′?AGGGGCCATCCACAGTCT TC?3′，產(chǎn)物258 bp。反應結(jié)束后分析PCR擴增曲線及熔解曲線，用2?△△Ct法進行相對定量分析，并進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增特異性。

三、Western印跡法檢測各組樣本中PKD1及其磷酸化位點在蛋白水平的表達

用RIPA裂解液提取蛋白，BCA法測定樣品蛋白質(zhì)濃度，SDS?聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，清洗后置于5%脫脂奶粉液中室溫封閉。加一抗4℃過夜后加二抗，避光條件下?lián)u床振蕩1 h，清洗后應用UVP凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像，ImageJ軟件分析灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計算目的條帶與內(nèi)參的灰度比值作為最終結(jié)果。

四、免疫組化染色檢測目標蛋白PKD1及其磷酸化位點在各組樣本中的表達

石蠟標本4 μm連續(xù)切片后，60℃烘烤1 h，常規(guī)脫蠟至水，抗原修復，3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，滴加一抗，4℃過夜，滴加二抗（PV6001），37℃溫箱孵育20 min，以上各步驟結(jié)束后均以磷酸酸緩沖液（PBS）沖洗3遍。DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木素復染，氨水返藍，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用0.01 mol/L PBS（pH7.4）代替一抗作為陰性對照，已知PKD1表達陽性的浸潤性乳腺導管癌組織作為陽性對照。

免疫組化染色結(jié)果判定：PKD1、PKD1/pPKD1?ser916、PKD1/pPKD1?tyr463免疫組化結(jié)果均以細胞質(zhì)和（或）細胞膜出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性。由兩位高年資病理診斷醫(yī)師采用雙盲法分別獨立閱片，遵循統(tǒng)一的診斷標準，選擇免疫染色最多的區(qū)域，每個標本隨機取10個高倍視野，計數(shù)所有細胞及其中陽性細胞數(shù)。著色程度計分：基本無染色為0分，淺棕黃色為1分，棕色為2分，棕褐色為3分。著色細胞百分率計分：著色細胞占計數(shù)細胞百分率＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。最終評分=著色程度得分×著色細胞百分率得分，＜2分為陰性（－），≥2分為陽性（+），≥4分為強陽性（++）。

五、統(tǒng)計學分析

結(jié)果

一、實時定量PCR分析PRKD1 mRNA在各組中的表達

正常皮膚組織、SCC、Bowen病和AK組織中PRKD1 mRNA的表達量分別為0.64±0.09、5.37± 1.06、2.69±0.72和2.43±0.46，4組間差異有統(tǒng)計學意義（F=21.37，P＜0.05）。兩兩間多重比較顯示，SCC、Bowen病和AK組織中PRKD1 mRNA的表達水平均顯著高于正常組織（均P＜0.05），且SCC組中PRKD1 mRNA的表達量明顯高于Bowen病和AK組（均P＜0.05），Bowen病和AK組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

二、免疫組化分析PKD1及其磷酸化位點在各組中的表達

圖1 免疫組化分析蛋白激酶D1（PKD1）在各組織中的表達（×200） 1A：皮膚鱗狀細胞癌組織中PKD1主要集中在基底層、棘層細胞及異形細胞的細胞質(zhì)和細胞膜；1B：Bowen病組織中PKD1主要集中在下延的基底細胞帶和增厚的棘層細胞的細胞質(zhì)和細胞膜部位；1C：光線性角化病組織中PKD1主要集中基底細胞帶和棘層細胞的細胞質(zhì)和細胞膜部位；1D：正常表皮組織中PKD1少量表達于基底部位及部分棘層細胞的細胞質(zhì)和細胞膜部位；1E：陽性對照PKD1主要集中在癌細胞的細胞質(zhì)和細胞膜部；1F：陰性對照

PKD1在SCC和Bowen病組中主要表達在棘層細胞及異形細胞的細胞質(zhì)和細胞膜（圖1），且其陽性表達率明顯高于正常對照組（χ2Bowen病=4.29，χ2SCC=12.96，均P＜0.01），而AK組和正常對照組之間PKD1陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.20，P＞0.05），見表1。此外，SCC組中PKD1的陽性表達率隨鱗癌病理分級的提高而增加（表2）。pPKD1?ser916僅在部分高分化SCC癌巢中少量表達，而低分化SCC、AK、Bowen病及正常組織中均未見表達，各組中pPKD1?ser916陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。pPKD1?tyr463僅在SCC和Bowen病組織少量表達，在AK和正常對照組織中均未見表達（圖2）。SCC組和Bowen病組中pPKD1?tyr463陽性表達率均明顯高于AK組和正常對照組（均P＜0.01），但SCC組與Bowen病組間，及AK組與正常對照組間差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.01），見表1。此外，在SCC組中PKD1與pPKD1?tyr463的表達呈正相關(guān)（rcc=0.479，P＜0.05），見表3。

表1 PKD1及其磷酸化位點在各組皮損中的表達［例（%）］

表2 蛋白激酶D1（PKD1）在皮膚鱗狀細胞癌（SCC）各病理分級組織中的表達情況（例）

表3 蛋白激酶D1（PKD1）和磷酸化位點pPKD1?tyr463在皮膚鱗狀細胞癌組織中表達的相關(guān)性分析

圖2 蛋白激酶D1磷酸化位點pPKD1?tyr463在各組織中的表達（×200） 2A：皮膚鱗狀細胞癌組織中陽性表達主要集中在棘層細胞及異形細胞的細胞質(zhì)和細胞膜部位；2B：Bowen病組織中陽性表達主要集中在增厚的棘層鱗狀細胞細胞質(zhì)和細胞膜，以細胞膜為主；2C：光線性角化病組織呈陰性表達；2D：正常皮膚呈陰性表達

三、Western印跡測定結(jié)果

PKD1及pPKD1?ser916和pPKD1?tyr463在各組中的表達與免疫組化結(jié)果大致相符。與GAPDH內(nèi)參蛋白相比，PKD1僅在SCC和Bowen病組中高表達，pPKD1?tyr463僅在SCC組織中高表達，而pPKD1?ser916在各組中表達量均較低。見圖3和表4。

圖3 Western印跡法檢測各組蛋白激酶D1（PKD1）及其磷酸化位點Ser916和Tyr463的表達 1：正常皮膚；2：光線性角化病；3：Bowen病；4：皮膚鱗狀細胞癌

表4 蛋白激酶D1（PKD1）及其磷酸化位點pPKD1?ser916、pPKD1?tyr463在正常皮膚、光線性角化病（AK）、Bowen病、皮膚鱗狀細胞癌（SCC）組織中的表達（±s）

表4 蛋白激酶D1（PKD1）及其磷酸化位點pPKD1?ser916、pPKD1?tyr463在正常皮膚、光線性角化病（AK）、Bowen病、皮膚鱗狀細胞癌（SCC）組織中的表達（±s）

注：a：SNK?q檢驗，與正常皮膚對照組相比，P＜0.05；b：與AK組相比，P＜0.05

組別正常皮膚組AK組Bowen病組SCC組F值P值例數(shù)10 10 10 10 PKD1 0.100±0.074 0.307±0.098 1.664±0.102ab 2.075±0.722ab 2 432.044＜0.001 pPKD1?ser916 0.105±0.022 0.101±0.058 0.107±0.033 0.115±0.045ab 1 377.308＜0.001 pPKD1?tyr463 0.061±0.004 0.153±0.007 0.819±0.021ab 1.704±0.006ab 44 250.782＜0.001

討論

PKD1在靜息狀態(tài)的細胞中主要分布在細胞質(zhì)內(nèi)，處于低活性狀態(tài)，受到相關(guān)刺激而活化后被募集到細胞膜、細胞核或高爾基體等位置，參與調(diào)控細胞功能和多條細胞內(nèi)信號傳導通路［9］。相關(guān)研究證實，PKD1具有促進角質(zhì)形成細胞增殖，抑制其分化的作用［10?11］，在傷口愈合過程中可促進表皮細胞的增殖和遷移［12］，PKD1信號通路對維持表皮平衡具有至關(guān)重要的作用。Chiou等［13］研究證實，在皮膚腫瘤干細胞標記CD34陽性的細胞系中，通過抑制PKD1相關(guān)的信號通路可有效預防皮膚腫瘤的發(fā)生。Kempkes等［14］在黑素瘤細胞中下調(diào)PKD1的表達，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞增殖明顯下降，推測PKD1相關(guān)通路的失活可能有助于抑制黑素瘤細胞的增殖及對腫瘤微環(huán)境的維護。Ristich等［15］利用免疫組化的方法證實PKD1在正常皮膚、銀屑病和基底細胞癌中表達，初步推測其在增殖性皮膚病如銀屑病和皮膚腫瘤中可能發(fā)揮作用。

SCC與AK、Bowen病同為復層鱗狀上皮細胞來源的皮膚病變，這些皮膚疾病的發(fā)生發(fā)展都與日光中的紫外線有密切聯(lián)系，相關(guān)實驗證實，UVB通過Tyr463位點激活細胞中的PKD1，幫助遭受紫外線損傷而發(fā)生DNA突變的角質(zhì)形成細胞避免凋亡，且最終可能發(fā)展為皮膚腫瘤［8］。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，SCC組織中PRKD1 mRNA的表達量顯著高于正常皮膚組織、AK及Bowen病組織，而后兩者中PRKD1 mRNA含量也較正常皮膚組織高。PKD1總蛋白和pPKD1?tyr463在SCC和Bowen病的表達明顯高于正常皮膚對照組和AK組，且主要分布在細胞異形性明顯的部位，表現(xiàn)出隨著細胞異形性的增加表達量增多的趨勢。PKD1在皮膚侵襲性鱗癌、原位鱗癌及癌前病變的表達情況國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道，我們的研究提示，PKD1及pPKD1?tyr463可能參與復層鱗狀上皮來源的皮膚腫瘤的形成和進一步發(fā)展，在SCC形成進程中PKD1可能通過Tyr463位點活化而發(fā)揮促進作用，有望成為SCC治療的新靶點。

氧化應激條件下PKD1活化通過PKD1?IKK?NF?κB途徑幫助表皮角質(zhì)形成細胞存活，Ser916位點是該途徑中PKD1的最終活化位點，在PKD1結(jié)構(gòu)修飾上發(fā)揮重要作用［16］。而我們僅通過免疫組化法檢測到部分高分化SCC組織的癌巢中有少量pPKD1?ser916的表達，低分化SCC組織中反而未發(fā)現(xiàn)，且Western印跡顯示，各組織中該位點條帶灰度值均很低。Ser916位點在SCC發(fā)生發(fā)展中的作用有待進一步探究。

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Expression of protein kinase D1 and its phosphorylation at tyr463 and ser916 in squamous cell carcinoma,Bowen′s disease and actinic keratosis

Gu Jing,Liu Baoguo,Zhou Meng,Miao Guoying, Lyu Chao,Chai Xiaolei
Graduate School of Chengde Medical University,Chengde 067000,Hebei,China（Gu J,Zhou M）; Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering,Handan 056002,Hebei, China（Liu BG,Miao GY,Lyu C）;Department of Blood Transfusion,Affiliated Hospital of Hebei University of

Liu Baoguo,Email:lbg66@163.com

ObjectiveTo measure the expression of protein kinase D1（PKD1）,tyr463?phos?phorylaed PKD1（pPKD1?tyr463）and ser916?phos?phorylaed PKD1（pPKD1?ser916）in squamous cell carcinoma（SCC）,Bowen′s disease（BD）and actinic keratosis（AK）,and to explore their significance.MethodsFresh tissue samples were resected from lesions of patients with SCC（SCC group）,BD（BD group）and AK（AK group）,as well as from normal skin of healthy human controls（control group）,and each group had a sample size of 10.Real?time RT?PCR was performed to measure the mRNA expression of protein kinase D1 gene（PRKD1）,and Western blot analysis to determine the protein expression of PKD1, pPKD1?tyr463 and pPKD1?ser916.In addition,immunohistochemical study was conducted to determine the expression of PKD1,pPKD1?tyr463 and pPKD1?ser916 in another 50 paraffin?embedded skin samples of SCC,20 samples of BD,20 samples of AK and 10 normal skin samples.Results PRKD1 mRNA expression significantly differed among the control group（0.64±0.09）,SCC group（5.37±1.06）,BD group（2.69± 0.72）and AK group（2.43±0.46）（F=21.37,P＜0.05）,and was significantly higher in the SCC,BD and AK groups than that in the control group（P＜0.05）,as well as in the SCC group than that in the AK and BD groups（bothP＜0.05）.However,no significant difference in the PRKD1 mRNA expression was observed between the BD group and AK group（P＞0.05）.Immunohistochemical study showed that the total PKD1 protein and pPKD1?tyr463 in the SCC and BD groups were mainly expressed in the cytoplasm and cell membrane of spinous layer cells and atypical cells,and their expression rates were significantly higher than those in the AK group and control group（allP＜0.01）.The pPKD1?ser916 was only slightly expressed in some cancer nests of well?differentiated SCC tissues,but not in poorly?differentiated SCC,AK, BD tissues and normal skin tissues.In the SCC group,the expression rate of PKD1 increased with the increase of the pathological grade of SCC,and the PKD1 expression was positively correlated with pPKD1?tyr463 expression（rcc=0.479,P＜0.05）.Western blot results were consistent with immunohistochemical findings.ConclusionPKD1 and pPKD1?tyr463 may be involved in the development and differentiation of skin tumors derived from stratified squamous epithelium,and PKD1 may exert promotive effects on the formation of cutaneous SCC by activating the Tyr463 phosphorylation site.

Carcinoma,squamous cell;Bowen′s disease;Keratosis,actinic;Protein kinase D1

劉保國，Email：lbg66@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.04.004

河北省2016年度科技支撐計劃（16277724D）；河北省政府資助臨床醫(yī)學優(yōu)秀人才培養(yǎng)項目（361037）

Engineering,Handan 056002,Hebei,China（Chai XL）

Fund programs:Science Supply Plan of Hebei Province in 2016（16277724D）;Talents Training Program in Clinical Medicine Sponsored by Hebei Government（361037）

2016?08?01）

（本文編輯：周良佳 顏艷）