伊曲康唑、特比萘芬和他克莫司單用及聯合對皮炎外瓶霉的體外抗真菌作用

何承彥 孫毅 高露娟 李明 曾同祥

434100湖北荊州，長江大學第二臨床醫學院 荊州市中心醫院皮膚科（何承彥、孫毅、曾同祥）；復旦大學附屬中山醫院皮膚科（高露娟、李明）

伊曲康唑、特比萘芬和他克莫司單用及聯合對皮炎外瓶霉的體外抗真菌作用

何承彥 孫毅 高露娟 李明 曾同祥

434100湖北荊州，長江大學第二臨床醫學院 荊州市中心醫院皮膚科（何承彥、孫毅、曾同祥）；復旦大學附屬中山醫院皮膚科（高露娟、李明）

目的探討他克莫司與伊曲康唑、特比萘芬聯合對皮炎外瓶霉的體外抗真菌效果。方法參考美國臨床實驗室標準化研究所M38?A2方案，測定特比萘芬和伊曲康唑對12株皮炎外瓶霉的最低抑菌濃度；利用棋盤法，測定他克莫司和伊曲康唑或特比萘芬的聯合抗皮炎外瓶霉效果。結果特比萘芬和伊曲康唑對皮炎外瓶霉最低抑菌濃度范圍分別為（0.06～0.125）mg/L和（0.5～1）mg/L。他克莫司和特比萘芬聯合對5株皮炎外瓶霉、他克莫司和伊曲康唑聯合對10株皮炎外瓶霉有協同作用。兩組均無拮抗作用。結論他克莫司在體外與伊曲康唑或特比萘芬聯合應用時，能夠增加皮炎外瓶霉對伊曲康唑和特比萘芬的敏感性。

伊曲康唑；藥物協同作用；體外研究；皮炎外瓶霉；他克莫司；特比萘芬

皮炎外瓶霉是暗色絲孢霉病的主要致病菌之一［1］。它不僅可以引起皮膚、皮下組織感染，還可以引起播散性感染，其中神經系統感染多見，死亡率高達90%［2?3］。特比萘芬和伊曲康唑是治療皮膚及皮下組織真菌感染最常用的系統性抗真菌藥物，但對暗色絲孢霉病的療效較差［3?5］。他克莫司是一種鈣調磷酸酶抑制劑，多項研究已證實，他克莫司和抗真菌藥物聯合對煙曲霉、念珠菌、皮膚癬菌、毛霉等多種致病性真菌具有協同效應［6?9］。為了開發新型抗真菌聯合治療方案，我們參照美國臨床實驗室標準化研究所頒布的M38?A2方案［10］，以微量液基稀釋法測定他克莫司、特比萘芬和伊曲康唑對12株皮炎外瓶霉的抗真菌效應；同時利用棋盤法測定他克莫司與該兩種抗真菌藥物聯合的抗皮炎外瓶霉效果。

材料與方法

一、實驗菌株

12株皮炎外瓶霉臨床株均保存于荊州市中心醫院皮膚科真菌實驗室，所有菌株均經過形態學及分子生物學鑒定。每株菌在實驗前均在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基斜面上活化（35℃，7 d）。ATCC22019為本藥敏試驗的質控菌株。

二、抗真菌藥物

伊曲康唑（批號84625?61?6，純度＞99%）、特比萘芬（批號T8826，純度＞99%）和他克莫司（批號F467，純度＞99%）均為美國Sigma公司產品。將藥物以分析純二甲基亞砜溶解成儲存液，濃度均為1 600 mg/L。

三、微量液基稀釋法

參考美國臨床實驗室標準化研究所M38?A2方案，按照方案推薦方法配制培養基，用經三氮嗎啡丙磺酸鈉緩沖（pH7.0）的RPMI 1640液體培養基過濾滅菌。收集皮炎外瓶霉孢子，以血細胞計數板調整孢子量為（1～5）×106CFU/ml；然后以RPMI 1640液體培養基稀釋100倍，接種終濃度為（1～5）× 104CFU/ml。倍比稀釋后，將2倍終濃度的受試藥物加入96孔板，每孔加入100 μl，再加入100 μl稀釋后的菌懸液，同時設立生長對照（無藥孔）和陰性對照（無菌孔），35℃孵育72 h。伊曲康唑和特比萘芬的工作濃度范圍均為0.015～2 mg/L，他克莫司為0.125～8 mg/L。肉眼觀察判讀結果，最低抑菌濃度（MIC）定義為肉眼觀察到無真菌生長的最低濃度。所有的藥敏試驗均重復操作2次。

四、體外聯合藥物敏感性

藥物聯合敏感性測試采用棋盤法，即在96孔板中分別加入不同濃度的兩種藥物。自左向右1～8列為聯合區，每孔加入4倍終濃度的藥物倍比稀釋液各50 μl；第1～8列為特比萘芬或伊曲康唑，藥物終濃度為0.015～2 mg/L，每列濃度一致；第1～7行分別加入他克莫司至終濃度為0.125～8 mg/L，每行濃度一致。第9、10列為單獨用藥區，藥物終濃度梯度同聯合區。同時設立生長對照和空白對照。接種時除陰性對照孔外其余各孔均加入100 μl的2倍終濃度菌懸液，35℃孵育72 h后觀察結果。分數抑菌濃度判定：與生長對照孔相比，生長100%抑制所對應的最低藥物濃度，包括各藥物單獨和聯合時的MIC值。聯合用藥時各藥物的MIC值分別除以單獨用藥時MIC值的商的和，即分數抑菌濃度指數（FICI）=MIC A聯合/MIC A單獨+MIC B聯合/MIC B單獨。藥物之間相互作用如下：FICl＜0.5為協同作用，0.5～4為無相互作用，＞4為拮抗作用。

結果

一、單藥對皮炎外瓶霉的體外藥物敏感性

他克莫司單藥對12株皮炎外瓶霉的MIC均＞8 mg/L。伊曲康唑對5株皮炎外瓶霉的MIC為0.5 mg/L，7株為1 mg/L。特比萘芬對5株皮炎外瓶霉菌株的MIC為0.125 mg/L，7株為0.06 mg/L。見表1。

表1 伊曲康唑、特比萘芬和他克莫司單用及聯合抗皮炎外瓶霉效應

二、他克莫司聯合伊曲康唑或特比萘芬對皮炎外瓶霉的體外藥物敏感性

他克莫司與伊曲康唑聯合后，伊曲康唑2株0.03 mg/L，4株0.06 mg/L，4株0.125 mg/L，2株0.25 mg/L；他克莫司對皮炎外瓶霉的MIC 6株降至1 mg/L，6株降至3 mg/L；FICI值顯示，10株FICI＜0.5為協同作用，2株FICI為0.5～4無相互作用。見表1。

他克莫司與特比萘芬聯合后，他克莫司對皮炎外瓶霉的MIC 6株降至0.5 mg/L，3株1 mg/L，3株2 mg/L；特比萘芬3株0.015 mg/L，5株0.03 mg/L，3株0.06 mg/L，1株0.125 mg/L；FICI值顯示，5株FICI＜0.5為協同作用，7株FICI為0.5～4無相互作用。見表1。

討論

他克莫司是從非致病真菌中提取的大環內酯類免疫抑制劑，作用于鈣調磷酸酶，抑制多種蛋白的去磷酸化過程。鈣調磷酸酶是鈣依賴性信號傳導通路，對多種真菌胞壁的完整性、菌絲生長、毒力及真菌對抗真菌藥物耐受都具有重要作用，如念珠菌、曲霉、隱球菌等［11］。他克莫司與抗真菌藥物聯合對曲霉、念珠菌、皮膚癬菌、毛霉等多種致病性真菌具有協同效應［6?9］。

皮炎外瓶霉所致皮膚及系統感染治療棘手。盡管體外藥敏提示皮炎外瓶霉抗真菌藥物敏感性尚可，但臨床療效較差［3?5］。伊曲康唑及特比萘芬是目前使用較廣泛的抗真菌藥物。本研究結果顯示，伊曲康唑及特比萘芬對皮炎外瓶霉的MIC范圍分別為0.5～1 mg/L及0.06～0.125 mg/L，兩者對皮炎外瓶霉的體外敏感性較好。雖然他克莫司單用對皮炎外瓶霉不敏感，但當與伊曲康唑和特比萘芬聯合時，能夠增加受試菌株對該兩個藥物的敏感性。雖然伊曲康唑的MIC均值較特比萘芬高，但他克莫司與伊曲康唑的協同作用比例（10/12）明顯高于與特比萘芬的協同作用比例（5/12）。體內外研究顯示，抑制鈣調磷酸酶可增強麥角固醇合成抑制劑（唑類及特比萘芬）抗須毛癬菌、念珠菌、米根霉等作用［12?13］。其潛在機制可能為他克莫司與麥角固醇合成酶抑制劑聯合能夠增強致病菌對唑類藥物敏感性，從抑菌作用轉變成殺菌作用；而用麥角固醇抑制劑可導致細胞膜損傷，細胞內他克莫司濃度增加［14?15］。此外，他克莫司與棘白菌素類藥物聯合對耐卡泊芬凈念珠菌也具有協同效應［11］。當然，其潛在的機制還需進一步研究。

本研究豐富了他克莫司與抗真菌藥物聯合作用的數據，同時也為皮炎外瓶霉感染的治療提供一定的理論基礎。當然，由于皮炎外瓶霉體外數據和體內抗感染效果存在一定差異，還需要更多的研究來進一步證實其在臨床實踐的可行性。

志謝 北京大學第一醫院皮膚科李若瑜教授贈予皮炎外瓶霉菌株

［1］Li DM,Li RY,de Hoog GS,et al.FatalExophialainfections in China,with a report of seven cases［J］.Mycoses,2011,54（4）: e136?142.DOI:10.1111/j.1439?050 7.2010.01859.x.

［2］Chakrabarti A.Epidemiology of central nervous system mycoses［J］.Neurol India,2007,55（3）:191?197.

［3］Patel AK,Patel KK,Darji P,et al.Exophiala dermatitidisendocarditis on native aortic valve in a postrenal transplant patient and review of literature onE.dermatitidisinfections［J］. Mycoses,2013,56（3）:365?372.DOI:10.1111/myc.12009.

［4］Kondori N,Gilljam M,Lindblad A,et al.High rate ofExophiala dermatitidisrecovery in the airways of patients with cystic fibrosis is associated with pancreatic insufficiency［J］.J Clin Microbiol, 2011,49（3）:1004?1009.DOI:10.1128/JCM.01899?10.

［5］Revankar SG,Sutton DA.Melanized fungi in human disease［J］. Clin Microbiol Rev,2010,23（4）:884?928.DOI:10.1128/ CMR.00019?10.

［6］Steinbach WJ,Singh N,Miller JL,et al.In vitrointeractions between antifungals and immunosuppressants againstAspergillus fumigatusisolates from transplant and nontransplant patients［J］. Antimicrob Agents Chemother,2004,48（12）:4922?4925.DOI: 10.1128/AAC.48.12.4922?4925.2004.

［7］Sun S,Li Y,Guo Q,et al.In vitrointeractions between tacrolimus and azoles againstCandida albicansdetermined by different methods［J］.Antimicrob Agents Chemother,2008,52（2）:409?417.DOI:10.1128/AAC.01070?07.

［8］Narreddy S,Manavathu E,Chandrasekar PH,et al.In vitrointeraction ofposaconazolewith calcineurin inhibitorsand sirolimus against zygomycetes［J］.J Antimicrob Chemother, 2010,65（4）:701?703.DOI:10.1093/jac/dkq020.

［9］陳淳,陳啟紅,孫毅,等.低濃度他克莫司與抗真菌藥物聯合的體外抗真菌效應［J］.中國真菌學雜志,2015,10（4）:207?209. DOI:10.3969/j.issn.1673?3827.2015.04.004.

［10］Clinical and Laboratory Standards Institute.CLSI document M38?A2 reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi:approved standard［S］.USA:Wayne PA,2008.

［11］Zhang J,Silao FG,Bigol UG,et al.Calcineurin is required for pseudohyphal growth,virulence,and drug resistance inCandida lusitaniae［J］.PLoS One,2012,7（8）:e44192.DOI:10.1371/ journal.pone.0044192.

［12］Onyewu C,Eads E,Schell WA,et al.Targeting the calcineurin pathway enhancesergosterolbiosynthesisinhibitorsagainstTrichophyton mentagrophytes in vitroand in a human skin infection model［J］.Antimicrob Agents Chemother,2007,51（10）:3743?3746.DOI:10.1128/AAC.00492?07.

［13］Onyewu C,Blankenship JR,Del PM,et al.Ergosterol biosynthesis inhibitors become fungicidal when combined with calcineurin inhibitors againstCandida albicans,Candida glabrata,andCandida krusei［J］.Antimicrob Agents Chemother,2003,47（3）: 956?964.

［14］Uppuluri P,Nett J,Heitman J,et al.Synergistic effect of calcineurin inhibitors and fluconazole againstCandida albicansbiofilms［J］.Antimicrob Agents Chemother,2008,52（3）:1127?1132.DOI:10.1128/AAC.01397?07.

［15］Shirazi F,Kontoyiannis DP.The calcineurin pathway inhibitor tacrolimus enhances thein vitroactivity of azoles against Mucorales via apoptosis［J］.Eukaryot Cell,2013,12（9）:1225?1234.DOI:10.1128/EC.00138?13.

In vitroantifungal activity of tacrolimus alone or in combination with itraconazole or terbinafine against

Exophiala dermatitidisHe Chengyan,Sun Yi,Gao Lujuan,Li Ming,Zeng Tongxiang
Department of Dermatology,Jingzhou Central Hospital,The Second Clinical Medical College,Yangtze University,Jingzhou 434100,Hubei,China（He CY,Sun Y,Zeng TX）;Department of Dermatology,

s:Gao Lujuan,Email:gao_lujuan@163.com;Sun Yi,Email:jzzxyysy@163.com

ObjectiveTo evaluatein vitroantifungal activity of tacrolimus combined with itraconazole or terbinafine againstExophiala dermatitidis（E.dermatitidis）.Methods The minimum inhibitory concentrations（MICs）of itraconazole and terbinafine against 12 strains ofE.dermatitidiswere determined using the Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）broth microdilution susceptibility method（M38?A2 Document）.A broth microdilution checkerboard method was used to evaluate thein vitroantifungal activity of tacrolimus combined with itraconazole or terbinafine againstE.dermatitidis.ResultsThe MIC ranges of terbinafine and itraconazole againstE.dermatitidiswere 0.060-0.125 mg/L and 0.5-1 mg/L,respectively.The combination of tacrolimus with terbinafine showed synergistic inhibitory effects against 5 strains ofE.dermatitidis,while the combination of tacrolimus with itraconazole revealed synergistic effects against 10 strains ofE.dermatitidis.No antagonism was observed in either of the two combinations.ConclusionIn vitrocombination of tacrolimus with itraconazole or terbinafine can enhance the antifungal activity of itraconazole or terbinafine againstE.dermatitidis.

Itraconazole;Drug synergism;In vitro;Exophiala dermatitidis;Tacrolimus;Terbinafine

高露娟，Email：gao_lujuan@163.com；孫毅，Email：jzzxyysy@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.04.011

國家自然科學基金（81401677、31400131）；復旦大學附屬中山醫院優秀青年醫師計劃（2015ZSYXQN21）

Zhongshan Hospital,Fudan University,Shanghai 200032,China（Gao LJ,Li M）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（31400131,81401677）;Outstanding Youth Project of Zhongshan Hospital Fudan University（2015ZSYXQN21）

2016?08?12）

（本文編輯：吳曉初）