咖啡對小鼠精子質量的急性影響

郭曉寧 王俊平 孫 燕 張玉婷 馬 躍

咖啡對小鼠精子質量的急性影響

郭曉寧1王俊平2孫 燕2張玉婷1馬 躍2

目的 探討咖啡對小鼠精子質量的急性影響。方法 健康雄性昆明種小鼠40只，隨機分為對照組和咖啡低、中、高劑量組，每天分別予10 ml/kg 0.9%氯化鈉注射液、7.5 mg/kg、15 mg/kg和30 mg/kg咖啡灌胃；7 d后處死小鼠，檢測各組小鼠的體重變化、臟器系數；顯微鏡下計數小鼠的精子數量、精子活動率、精子存活率、精子畸形率。結果 低、中、高劑量組小鼠體重、肝臟系數、睪丸系數、附睪系數、精子活動率、精子存活率、精子畸形率與對照組比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。但中、高劑量組小鼠的精子數量明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 咖啡對小鼠存活、活性和形態無明顯影響，但大量攝入可致小鼠精子數量減少。

咖啡；精子；臟器系數；精液質量；急性

隨著我國生育政策的放開，人們生活水平的提高，優生優育越來越得到重視。飲食與人類健康息息相關，尤其對優生優育的影響引起人們的廣泛關注。咖啡因其良好的口感和提神醒腦作用廣為人們喜愛，是世界上廣泛飲用的飲品之一，其主要成分是咖啡因，具有諸多對身體有益的生理功能，如提神醒腦、抗憂郁、控制體重、預防癌癥等[1]，能刺激中樞神經系統、心臟和呼吸系統。但是，有關咖啡對生殖功能的影響尚未見報道。本試驗以健康雄性昆明小鼠為研究對象，通過灌胃不同劑量的咖啡，觀察小鼠體重變化，計算肝臟、睪丸和附睪的臟器系數，同時觀察比較精子數量、存活率、活動率及精子形態的改變，評價咖啡對小鼠精子質量的急性影響，初步探討咖啡對小鼠是否具有生殖毒性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 選擇 7～8周齡健康的 SPF級昆明種雄性小鼠40只，體重29～36 g，購自沈陽醫學院實驗動物中心。按體重隨機分成 4個組別，即對照組10只、咖啡低劑量組10只、咖啡中劑量組10只和咖啡高劑量組10只。

1.2 主要儀器與試劑 MoticBA310-motic advanced 3.2顯微成像系統（motic）；HH?S112恒溫水浴箱（江蘇省醫療器械）；JJ2000Y型電子天平（常熟市雙杰測試儀器）。市售雀巢咖啡（東莞雀巢有限公司生產，批號：20160423），ART-1006精子沖洗培養液（Sage In-Vitro Fertilization，Inc.生產，批號：16190191），1%伊紅溶液。

1.3 方法 咖啡濃度的設定參照成年人每天1杯咖啡的量，設定灌胃小鼠的低劑量為7.5 mg/kg，中劑量為15 mg/kg，高劑量為30 mg/kg。對照組為10 ml/kg的0.9%氯化鈉注射液。每天定時給對照組小鼠0.3 ml 0.9%氯化鈉注射液灌胃，給低、中、高劑量組小鼠分別以0.3 ml不同濃度的咖啡灌胃，連續灌胃7 d，7d后處死，檢測相關指標。

1.4 體重變化測定 分別稱量每只小鼠灌胃前的體重和灌胃7 d后的體重，體重變化（g）=灌胃后體重（g）－灌胃前體重（g）。

1.5 臟器系數測定 將小鼠摘眼球取血并脫臼處死，分離其肝臟、附睪和睪丸，分別稱重，計算各臟器系數。臟器系數=臟器濕重（g）/小鼠體重（g）×100%。

1.6 精液質量分析 將分離的左側附睪用眼科剪橫切一次，縱切兩次，放入EP管（0.2 ml精子緩沖液），放入37 ℃恒溫箱30 min，待精子自由游出。

1.6.1 精子活動率和精子存活率 22 ℃室溫下，取10 μl新鮮制備的精子懸液滴于血細胞計數板上，測量精子活率，10min內結束。將精子活動分為四級：Ⅰ級快速、直線的前向運動，Ⅱ級慢速或遲鈍的直線或非直線前向運動，Ⅲ級不向前的運動，Ⅳ級不活動。精子活動率（%）=（Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ）精子數/（Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ）精子數×100%。精子存活率（%）=（Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ）精子數/檢查的精子數×100%。

1.6.2 精子計數 取精子懸液65 ℃水浴孵育10 min后，取10 μl于血細胞計數板計數池內，根據紅細胞計數法，計數精子數，換算成精子相對密度進行比較。

1.6.3 精子畸形率 參考范瑞泉等[2]改良的方法，將剩余的精子懸液加入適量1%伊紅溶液，混勻染色20 min后，取1滴于潔凈玻片，均勻推片，空氣中自然干燥，用中性樹脂封片，制成精液樣本片。在高倍鏡下觀察精子形態，記錄畸形的精子數量，計算畸形率。精子畸形大致可分為卷曲、大頭、雙頭、雙尾、無鉤、香蕉形等[3]。有頭無尾、輪廓不清、重疊和明顯被剪碎的精子不計。精子畸形率（%）=畸形的精子數/檢查的精子數×100%。

1.7 統計學分析 采用SPSS 20.0統計軟件分析數據，計量資料以±s表示，組間比較用t檢驗均以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體重變化比較 各組小鼠灌胃前后體重的變化如表 1所示，隨著實驗的進行，體重逐漸增加，咖啡低、中、高劑量組的小鼠體重增加值略低于對照組，但組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組小鼠灌胃前后的體重變化情況(g,±s)

表1 各組小鼠灌胃前后的體重變化情況(g,±s)

組別 只數 灌胃前 灌胃7 d 體重變化低劑量組 10 32.87±3.87 34.37±4.19 1.50±1.06中劑量組 10 32.27±7.30 33.91±7.70 1.64±1.27高劑量組 10 30.38±6.18 31.72±6.06 1.34±1.08對照組 10 30.34±5.93 32.18±6.59 1.84±1.24

2.2 臟器系數、睪丸系數和附睪系數比較 與對照組相比，咖啡低、中、高劑量組的小鼠肝臟系數均有不同的降低，但組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。低、中、高劑量組小鼠的睪丸系數和附睪系數與對照組相比持平或略有增大，無劑量-效應關系，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠的臟器系數比較(%,±s)

表2 各組小鼠的臟器系數比較(%,±s)

對照組 10 6.72±1.56 0.53±0.17 0.08±0.03組別 只數 肝臟系數 睪丸系數 附睪系數低劑量組 10 5.74±1.26 0.66±0.11 0.10±0.03中劑量組 10 6.64±1.73 0.52±0.10 0.08±0.02高劑量組 10 5.82±2.04 0.52±0.12 0.10±0.04

2.3 精液質量評價 ①精子相對密度：與對照組相比，咖啡中、高劑量組精子相對密度明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），但不存在明顯的劑量-效應關系。低劑量組精子相對密度與對照組相差不大，差異無統計學意義（P＞0.05）。②精子存活率：與對照組相比，咖啡低劑量組精子存活率有增高趨勢，中、高劑量組精子存活率略有降低，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。③精子活動率和畸形率：咖啡低、中、高劑量組精子活動率和畸形率均與對照組相近，無劑量-效應關系，差異無統計學意義（P＞0.05），見表 3。鏡下檢測可見多種類型的精子形態異常，如卷曲、小頭、無定型、雙尾和雙頭畸形等（圖1）。

表3 各組小鼠的精液質量評價(±s)

表3 各組小鼠的精液質量評價(±s)

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別 只數精子存活率(%)精子活動率(%)精子相對密度精子畸形率(%)對照組 10 412.50±151.53 67.99±7.99 68.25±75.78 5.76±4.50低劑量組 10 433.50±170.15 73.33±5.99 68.48±63.56 6.49±3.33中劑量組 10 244.25±77.19*63.17±15.91 66.03±13.59 6.02±8.23高劑量組 10 221.00±137.37*67.98±9.91 64.56±16.72 5.44±2.12

圖1 小鼠多種類型的精子形態（400×）

3 討論

體重是動物實驗中一項重要的非特異性指標，體重的變化可以綜合地反映動物機體的中毒效應[4]。本實驗對照組和咖啡各劑量組小鼠均正常生長，且活動狀態良好，體重自然增長，咖啡低、中、高劑量組的小鼠體重增長均略低于對照組，差異不顯著。短期灌胃咖啡未引起小鼠體重明顯變化，可繼續進行亞急性或長期試驗研究。

臟器系數的變化通常可以較好地反映藥物對該臟器的影響或者初步的毒性判斷，也可以作為尋找毒物作用靶器官的重要線索[5]。經過咖啡連續灌胃7d后，咖啡低、中、高劑量組的小鼠肝臟系數、睪丸系數、附睪系數與對照組比較差異均無統計學意義，說明短期攝入咖啡對臟器影響不明顯。

精液質量是評價雄性生育能力的最直觀、最重要的指標，主要通過精子數量、精子活動率等參數來進行評估。精子數量減少、活動率下降以及畸形率升高往往會導致精子的受精能力下降，從而導致男性不育。本研究咖啡中、高劑量組與對照組比較，小鼠精子相對密度明顯減少，即精子數量減少差異顯著。表明咖啡對小鼠的精子數量有影響，連續7 d攝入咖啡大于15 mg/kg即可導致小鼠精子數量明顯減少，但是其活動率、存活率和畸形率未受影響。精子數量減少，運動能力強的精子也相對減少。小鼠精子數量質量的降低，會減少精子到達并且進入卵子的機率，影響受精率，進而可能導致生殖率降低。而低劑量組小鼠精子數量和存活率大于對照組，其他指標兩者也無顯著差異，所以短期少量攝入咖啡對精子質量基本無影響，甚至有積極作用。

綜上，短期過量攝入咖啡能明顯減少小鼠精子數量，對精子存活率、活動率和畸形率影響不大。咖啡可能導致精液質量下降，對人類生殖健康的影響值得密切關注，并進一步研究。

[1]羅妙莎,董蕾,郭曉燕.咖啡與肝臟疾病[J].胃腸病學和肝病學雜志,2016,25(3):340-343.

[2]范瑞泉,魏青,丘欽英,等.小鼠精子畸形試驗改良法與傳統法效果比較[J].華南預防醫學,2004,30(2):51-52.

[3]申涌,劉詠梅.枸杞多糖對甲醛所致雄性小鼠生殖毒性的拮抗作用[J].貴州醫科大學學報,2017,42(4):440-443.

[4]田永剛,張迎梅.低劑量三聚氰胺對小鼠精子質量影響的研究[J].四川動物,2010,29(3):466-468.

[5]孫建新,安娟,連軍.影響實驗動物臟器重量及臟器系數因素分析[J].實驗動物科學,2009,26(1):49-51.

10.12010/j.issn.1673-5846.2017.10.009

1沈陽醫學院附屬中心醫院，遼寧沈陽 110024

2沈陽醫學院，遼寧沈陽 110034

沈陽市衛生和計劃生育委員會科研項目[沈衛辦（2015）478號]

郭曉寧，碩士，主管藥師。主要從事臨床藥學工作

王俊平，教授，博士。E-mail：greennasi@yahoo.com