3個中華鱉群體遺傳多樣性的微衛星標記分析

陳 靜，何吉祥，黃 龍，吳本麗，孫和權，宋光同，陳貴生，王曉健

（1.安徽省農業科學院水產研究所，安徽 合肥 230031；2. 安慶市西江水產養殖股份有限公司，安徽 安慶 246053；3. 安徽省巢湖市柘皋鎮農業綜合服務站，安徽 合肥 238000；4.安徽省合肥市長豐縣杜集鄉農業綜合服務站，安徽 合肥 231100）

3個中華鱉群體遺傳多樣性的微衛星標記分析

陳 靜1，何吉祥1，黃 龍1，吳本麗1，孫和權2，宋光同1，陳貴生3，王曉健4

（1.安徽省農業科學院水產研究所，安徽 合肥 230031；2. 安慶市西江水產養殖股份有限公司，安徽 安慶 246053；3. 安徽省巢湖市柘皋鎮農業綜合服務站，安徽 合肥 238000；4.安徽省合肥市長豐縣杜集鄉農業綜合服務站，安徽 合肥 231100）

為了給武昌湖中華鱉的遺傳資源保護和利用提供較為準確的基礎數據，利用微衛星標記技術，對中華鱉武昌湖野生群體和2個養殖群體進行遺傳多樣性分析。結果顯示：武昌湖鱉群體、日本鱉群體、黃沙鱉群體的平均等位基因數（Na）分別為11.5、9.1、7.9，平均有效等位基因數（Ne）分別為6.3、3.7、3.1，平均觀測雜合度（Ho ）分別為 0.5667、0.5222、0.4462，平均期望雜合度（He）分別為0.6987、0.5953、0.5648，多態信息含量（PIC）分別為 0.6672、0.5551、0.5303，武昌湖群體遺傳多樣性較高。基于Nei’s遺傳距離和遺傳分化指數顯示，目前武昌湖群體中華鱉種質資源保存較好。

中華鱉；武昌湖；熒光SSR；遺傳多樣性；遺傳分化

中華鱉（Pelodiscus sinensis）蛋白質含量高，營養豐富，肉味鮮美，鱉甲、頭、肉、血、膽等均可入藥，具有較高的經濟價值和藥用價值，是食療滋補的上品［1］。中華鱉產量由1993年0.44萬t提高到2015年34.16萬t，一度成為集約化程度最高、養殖效益最好的產業之一，在水產養殖業中具有重要地位。

遺傳多樣性是物種生存適應和發展進化的前提。一個居群或物種的遺傳多樣性越高或遺傳變異越豐富，對環境變化的適應能力就越強。了解物種的遺傳變異，有利于對其種質資源管理保護和開發利用［2］。隨著中華鱉養殖業的迅猛發展，出現了種群混雜、種質退化等現象，嚴重影響其遺傳多樣性。

武昌湖位于安徽省西南部安慶市望江縣東北部，湖泊水面廣闊、資源豐富，是重要的水產基地之一，在2008年被確定為中華鱉國家級水產種質資源保護區，近年來采取了增殖、放養等措施保證野生中華鱉的數量。但由于缺乏管理措施和有效的鑒定手段，一些人工養殖的中華鱉混入武昌湖，兩者的基因發生一定程度的交流，破壞野生中華鱉完整遺傳信息的保留。劉陽等［2］、張至允等［3］對中華鱉的代表性群體黃河鱉、黃沙鱉、日本鱉、淮河鱉、洞庭湖鱉、鄱陽湖鱉、太湖鱉等群體進行了遺傳變異的微衛星分析，尚未見對中華鱉武昌湖群體的遺傳多樣性研究。本研究以養殖日本鱉群體和黃沙鱉群體為參照，采用微衛星分子標記技術對武昌湖野生中華鱉進行遺傳多樣性分析，以期通過對武昌湖鱉的種質鑒定了解其遺傳結構特征，為其遺傳資源的保護和利用提供較為準確的相關信息和依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2016年5月6日，于武昌湖采集野生中華鱉30只，在安慶市西江水產養殖股份有限公司采集日本鱉30只和黃沙鱉31只，剪取少許裙邊，放在裝有酒精的EP管中，帶回實驗室于-20℃貯存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用天根生化科技（北京）有限公司的組織基因組提取試劑盒（DP304）提取基因組 DNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性后，用紫外分光光度計檢測DNA的純度和濃度，并稀釋至10 ng/μL，-20℃保存備用。

1.2.2 微衛星檢測 從劉陽等［2］、張志允等［3］、張群英等［4］公開發表的中華鱉微衛星標記中選取12個，由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成引物。各對引物的正向引物5′端分別帶有FAM（藍色）或HEX（綠色）的特異性熒光標記用于測算擴增目的條帶大小。

PCR反應體系為15 μL，包括模板DNA 1 μL，10×buffer 1.5 μL，MgCl2（25 mmol/μL）1.5 μL，dNTPs （10 mmol/μL）各0.3 μL，上下游引物（10 pmol/μL）各 0.15 μL，TaqDNA 聚合酶（5 U/μL） 0.3 μL。PCR 反應程序為：94℃預變性 3 min；94℃ 30 s，55℃ 15 s，72℃ 30 s，35個循環；72℃延伸3 min。

將10倍稀釋的PCR產物1.5 μL、ROX 500內標0.25 μL和超純去離子甲酰胺12.5 μL充分混勻后，95℃變性5 min，迅速冰浴3 min，置ABI 3700XL測序儀進行毛細管電泳檢測。

1.2.3 數據統計及分析 用 Genographer 軟件根據分子量大小對擴增結果讀帶，統計每個引物在不同個體中的擴增情況。利用PopGene 32進行統計分析，計算各群體每個微衛星位點的等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、群體間遺傳距離（Da）、遺傳分化指數（Fst）。利用Picalc程序包計算各引物的多態信息含量（PIC）。基于Nei’s遺傳距離利用MEGA 5軟件進行UPGMA聚類分析。

2 結果與分析

2.1 微衛星引物擴增結果

供試的12對微衛星引物特征和擴增結果見表1。12個位點在3個中華鱉群體中表現出穩定的多態性，共檢測到182個等位基因，其平均等位基因數（Na）、平均有效等位基因數（Ne）、平均觀測雜合度（Ho）、平均期望雜合度（He）、多態信息含量（PIC）分別為9.5、4.38、0.5116、0.6196、0.5842。

表1 12對微衛星引物擴增結果

2.2 遺傳多樣性分析

武昌湖鱉（WC）、日本鱉（RB）和黃沙鱉（HS）的遺傳多樣性參數見表2。3個群體平均等位基因數（Na）分別為11.5、9.08、7.92，平均有效等位基因數（Ne）分別為6.28、3.73、3.13，平均觀測雜合度（Ho）分別為0.5667、0.5222、0.4462，平均期望雜合度（He）分別為0.6987、0.5953、0.5648，多態信息含量（PIC）分別為0.6672、0.5551、0.5303。

2.3 群體間的遺傳變異

3個中華鱉群體間的遺傳距離Da和遺傳分化指數Fst見表3。日本鱉群體和黃沙鱉群體遺傳距離最小（0.1417），武昌湖群體和黃沙鱉群體遺傳距離最大（0.4760），遺傳距離結果與Fst結果相符合。依據Nei’s遺傳距離構建聚類圖，結果（圖1）表明，日本鱉群體和黃沙鱉群體首先聚為一支，然后再與武昌湖鱉群體聚為一支。

圖1 基于遺傳距離的3個中華鱉群體的UPGMA聚類圖

表2 3個中華鱉群體的遺傳多樣性參數

表3 3群體中華鱉的遺傳距離和遺傳分化指數

2.4 Hardy-Weinberg 平衡分析

12個微衛星位點Hardy-Weinberg平衡χ2檢驗概率值P及遺傳偏離指數D值見表4。36個群體位點組合中（3群體×12位點），18個位點為顯著偏離，不符合Hardy-Weinberg平衡。36個群體位點組合中，25個群體位點組合D＞0，表現為雜合子過剩，其余11個群體位點表現為雜合子缺失（D＜0）。

表4 Hardy-Weinberg 平衡χ2 檢驗概率值（P）與遺傳偏離指數（D）

3 討論

3.1 熒光SSR分型更高效更準確

微衛星標記是分布于真核生物基因組中的簡單重復序列（simple sequence repeats，SSRs），也稱短串聯重復序列（simple tandem repeats，STRs）。因其在基因組中分布廣泛，具較高的多態性，呈共顯性遺傳等特點被廣泛應用于水產生物種群遺傳多樣性分析、種質資源保護、遺傳圖譜建立和 QTL 定位等研究中［5-6］。傳統的SSR片段分離采用聚丙烯酰胺凝膠電泳加銀染或放射顯影的方法，費時費力且分辨率較低。本研究利用目前被廣泛采用的毛細管電泳技術，通過熒光標記的PCR引物擴增微衛星位點區域序列，利用ABI 遺傳分析儀對熒光標記的DNA 片段進行毛細管電泳檢測，結合分子量內標計算DNA片段長度，使SSR分型更高效與準確［7］。

3.2 中華鱉武昌湖群體遺傳多樣性較高

有效等位基因數（Ne）作為群體遺傳變異的一個測度，反映某座位等位基因頻率分布的均勻程度。各等位基因頻率分布越均勻，群體整齊度和群體遺傳一致性越高，遺傳多樣性就越低。本研究中武昌湖群體、日本鱉群體、黃沙鱉群體平均有效等位基因數分別為6.28、3.73、3.13，武昌湖群體有效等位基因數比其他兩個群體略高，說明武昌湖群體遺傳多樣性高于日本鱉群體和黃沙鱉群體。

雜合度又稱為基因多樣度，一般被認為是度量群體遺傳變異的最適參數。就相同的分子標記而言，群體平均雜合度的高低反映了群體的遺傳一致性程度［8］。若群體平均雜合度高于0.5，表明該群體未受到高強度的選擇，擁有豐富的遺傳多樣性；若群體平均雜合度低于0.5，表明該群體遺傳多樣性較低。該研究中，武昌湖群體、日本鱉群體、黃沙鱉群體平均期望雜合度（He）分別為 0.6987、0.5953、0.5648，日本鱉群體和黃沙鱉群體略低于武昌湖群體，日本鱉群體和黃沙鱉群體長期人工養殖定向選育有關。張志允等［3］分析得出黃河鱉、淮河鱉、洞庭湖鱉、鄱陽湖鱉、太湖鱉的平均期望雜合度分別為 0.618、0.5515、0.5997、0.5904、0.5796；劉陽等［2］得出洞庭湖鱉、黃河鱉、黃沙鱉、日本鱉的平均期望雜合度分別為0.5194、0.5121、0.4955、0.4278。綜上比較而言，本研究中3個中華鱉群體的雜合度均具有較高水平，尤其是武昌湖鱉群體保持了較高的遺傳多樣性。

多態信息含量（PIC）是一個評價基因座位在群體中的多樣性程度的標準，平均PIC是衡量等位基因片段多態性的理想指標。當PIC＞0.5時，該位點為高度多態位點；當0.25＜PIC＜0.50時，為中度多態位點；當PIC＜0.25時，為低度多態位點［9］。該研究中武昌湖群體、日本鱉群體、黃沙鱉群體的PIC分別為0.6672、0.5551、0.5303，表明3個中華鱉群體的多態性屬于高度多態位點。張志允等［3］分析得出黃河鱉、淮河鱉、洞庭湖鱉、鄱陽湖鱉、太湖鱉的PIC分別為 0.5406、0.4872、0.5328、0.5206、0.5117；劉陽等［2］研究得出洞庭湖鱉、黃河鱉、黃沙鱉、日本鱉的PIC 分別為 0.456、0.423、0.43、0.402。總的來說，本研究中3個中華鱉群體的PIC值較高，遺傳多樣性較高。

3.3 3個中華鱉群體間的遺傳變異

群體間的遺傳關系一般表示為以等位基因頻率計算的2個群體之間的遺傳距離，2個群體之間的變異主要由分化時間的長短決定。Crawford 等［10］指出由微衛星得出的遺傳距離更能反映分化時間的長短，群體間遺傳距離越小，表示群體間的分化時間越短，群體間的遺傳關系越近，群體間遺傳變異性越低，相似系數就越大。遺傳分化指數是檢測群體間遺傳分化程度的重要指標之一［11］。本研究中，武昌湖鱉群體與日本鱉群體、黃沙鱉群體的遺傳距離分別為0.3522、0.4760，遺傳距離較大，同時遺傳分化指數也較大，說明武昌湖鱉和養殖的中華鱉遺傳分化程度較大，遺傳混雜少，種質保存較好。

3.4 基因型分布偏離Hardy-Weinberg平衡的原因

本研究所檢測的36個位點當中，有18個位點的基因型分布偏離了Hardy-Weinberg 平衡，25個位點表現為雜合子過剩，11 個位點表現為雜合子缺失，表明群體內基因頻率發生了較大改變。雜合子過剩現象一般出現在研究對象為相對小的群體或者封閉群體中，即一個養殖群體中的子代群體是由有限的親本所產生，創造者效應和瓶頸效應會導致連鎖不平衡現象，而在一個大的穩定群體中，連鎖不平衡現象幾乎為零［12］，而雜合子缺失則可能與自然選擇、種群內交、無效等位基因和稀有等位基因丟失等原因有關［13］。本研究中，日本鱉和黃沙鱉兩個養殖群體經過若干代閉鎖繁育和近親繁殖，導致雜合子過剩和缺失現象，而武昌湖野生群體，也出現連鎖不平衡現象，可能與種群近親繁殖或少許養殖中華鱉混入有關，一些位點隱性有害基因純合可致個體死亡，使純合子的頻率減少，雜合子的頻率增加，從而在某些位點上產生了雜合子過剩的現象，而如果有些位點的隱性純合子是存活的，這就增加了該位點純合子的頻率，減少了雜合子的頻率，從而在該位點上產生了雜合子缺失的現象。因此，有必要進一步加強武昌湖自然保護區的中華鱉保護，防止瓶頸效應發生，保證其充足的親本數量和較高的遺傳多樣性。

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Microsatellite marker analysis of genetic diversity in three populations of Trionyx sinensis

CHEN Jing1，HE Ji-xiang1，HUANG Long1，WU Ben-li1，SUN He-quan2，SONG Guang-tong1，CHEN Gui-sheng3，WANG Xiao-jian4
（1. Fishery Research Institute，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei 230031，China；2. Anqing Xijiang Fishery Limited Corporation，Anqing 246053，China；3. Agricultural Comprehensive Service Station of Zhegao Town，Chaohu City，Anhui Province，Hefei 238000，China；4. Agricultural Comprehensive Service Station of Duji Countyside，Changfeng County，Hefei City，Anhui Province，Hefei 231100，China）

To provide more accurate basic data for the genetic resources ofTrionyx sinensisof Wuchang lake，and protect and utilize their germplasm resources，microsatellite marker technology was used to analyze the genetic diversity ofT. sinensisfrom wild population of Wuchang lake and two breeding populations as experimental objects. The results showed that the average number of alleles（ Na）for the three populations were 11.5，9.1 and 7.9 respectively，average effective numbers of alleles（ Ne） were 6.3，3.7 and 3.1 respectively，average observed heterozygosity （ Ho） were 0.5667，0.5222 and 0.4462 respectively，average expected heterozygosity（ He） were 0.6987，0.5953 and 0.5648 respectively and the average polymorphism information content（ PIC） were 0.6672，0.5551 and 0.5303 respectively，the genetic diversity of Wuchang Lake population was higher，the Nei’s genetic distance and genetic differentiation showed that the germplasm resources preservation of Wuchang Lake population was better now.

Trionyx sinensis；Wuchang Lake；fluorescent SSR marker；genetic diversity；genetic differentiation

S917.4

A

1004-874X（2017）07-0141-06

陳靜，何吉祥，黃龍，等.3個中華鱉群體遺傳多樣性的微衛星標記分析［J］.廣東農業科學，2017，44（7）：141-146.

2017-05-02

安徽省科技攻關項目（1604a0702018）；安慶市科技計劃項目；安徽省農業科學院成果推廣項目（16E0505）；安徽省水產產業技術體系( 皖農科［2016］84號)

陳靜（1985-）, 女, 碩士, 助理研究員, E-mail: chenjingok5@163.com

何吉祥（1975-）, 男, 碩士, 副研究員, E-mail: hejixiang813@126.com

（責任編輯 崔建勛）