10種免疫相關基因在斜帶石斑魚組織中的表達分析

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(福建省水產研究所，福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013)

2017-09-15

基金頊目：廈門南方海洋研究中心項目(14GZP75NE39)；產學研協同創新及科技合作項目(3502Z20172001)；

省屬公益類科研院所基本科研專項(2014R1003-11)；福建省海洋高新產業發展專項(2014NO.21).

葛 輝(1984-)，男，助理研究員，從事水產生物疾病研究.E-mail：gehuizlj@163.com

林克冰(1964-)，女，研究員，從事海洋生物病害防治技術研究.E-mail：kebingl@sina.com

葛 輝，林克冰，周 宸，等.10種免疫相關基因在斜帶石斑魚組織中的表達分析[J].漁業研究，2017，39(5)：379-385.

10種免疫相關基因在斜帶石斑魚組織中的表達分析

葛輝，林克冰，周宸，吳建紹，朱志煌，陸振，鄭樂云，吳水清，林琪，黃種持

(福建省水產研究所，福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013)

采用相對實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)技術，以β-肌動蛋白(β-actin)的表達量作為內參，對健康養殖斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)不同組織(頭腎、心臟、肝臟、脾臟、鰓、肌肉、鰭、眼、腸道)中的10種免疫相關基因：免疫球蛋白(IgM)、CD4、MHCIIa、TCRβ、CD8a、MHCIa、ISP16、Mx、TNFR14、HSP90的mRNA表達量進行了研究。結果顯示，10種免疫相關基因在斜帶石斑魚的10種組織中均有表達。其中體液免疫相關基因[免疫球蛋白(IgM)、CD4和MHCIIa]在鰓中的表達量最高，在其他組織部位的表達量相對較少。細胞免疫相關基因(TCRβ、CD8a和MHCIa)也是在鰓中的表達量最高，在眼、肌肉、肝和腸的部位表達量相對較少。ISP16在鰓和肝中的表達量較高，在肌肉和腸中的表達量較低。Mx在鰓中的表達量較高，在肌肉和腸的表達量較低。TNFR14在眼的表達量較高，在腸的表達量較低。HSP90在鰓和肝中的表達量相對較高，在心和肌肉的表達量較低。

斜帶石斑魚；實時熒光定量PCR(qRT-PCR)；免疫基因

斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)屬于鮨科(Serranidae)，石斑魚屬(Epinephelus)，屬廣鹽性魚類。2014年全國石斑魚的產量為88 130 t，其中廣東、海南和福建的產量分別為36 138 t、24 783 t和24 676 t。隨著石斑魚養殖產量的急劇增加，而養殖戶缺乏科學的病害防治技術，導致石斑魚的病害問題日趨嚴重。對石斑魚的疾病防治除了要保持良好的養殖水環境、合理的養殖密度和藥物治療外，增強石斑魚自身的免疫能力具有其獨特的優越性。近年來，學者們陸續開展了益生菌、拮抗蛋白等研究來提高石斑魚的免疫能力。因此，開展石斑魚的免疫學相關的基礎研究具有很大的實踐意義[1-7]。

免疫(Immunity)是指機體對抗病原體引起疾病的能力，免疫系統是防御和維護自身穩定的一個防衛系統。魚類免疫系統包括免疫組織和器官、免疫細胞和體液免疫因子3大類。魚類的免疫相關器官和組織主要包括胸腺、腎臟、脾臟和粘膜相關淋巴組織等[8-9]。免疫球蛋白(IgM)、CD4和MHCIIa是體液免疫相關基因，TCRβ、CD8a和MHCIa是細胞免疫相關基因，ISP16、Mx和腫瘤壞死因子(TNFR14)是抗病毒通路相關蛋白，HSP90是分子伴侶。免疫組織和細胞是魚類防御系統的基礎，是魚類抵御病原入侵的最初防線，體液免疫因子作為免疫應答的效應分子對病原具有直接的防御作用[10-11]。本研究應用相對定量RT-PCR技術對健康斜帶石斑魚的不同組織(頭腎、心臟、肝臟、脾臟、鰓、肌肉、鰭、眼、腸道)中10種免疫相關基因[免疫球蛋白(IgM)、CD4、MHCIIa、TCRβ、CD8a、MHCIa、ISP16、Mx、TNFR14、HSP90]的mRNA表達水平進行研究，希望在分子水平上為斜帶石斑魚的免疫學研究提供基礎資料。

1 材料和方法

1.1材料

實驗所用斜帶石斑魚來源于漳州漳浦海區網箱養殖，選擇20尾體色正常、體質健壯、體表無損傷，平均體重在(80±3)g，養殖周期相同的個體用于實驗研究。采集時間為2016年3月18日。

1.2試劑、耗材和儀器

無菌水；0.9%生理鹽水；75%酒精；無菌吸管；解刨工具；凍存管；qPCR儀器，勻漿機。

1.3取樣方法

在取樣前，將取回的斜帶石斑魚暫養在實驗室，暫養用水取自其養殖場。取樣解剖前饑餓24 h。從養殖箱中隨機選取10尾石斑魚，解剖前測量體長、體重。先用無菌生理鹽水沖洗實驗用石斑魚體表，無菌條件下，用滅菌剪刀剪開魚體璧，分別取出頭腎、心臟、肝臟、脾臟、鰓、肌肉、鰭、眼、腸道，置于1.5 mL凍存管內，并立刻將其放入液氨中保存。

1.4 RNA提取

將樣品置于1 mL Trizol試劑(Qiagen)中，并分別勻漿。按照Trizol試劑使用說明書，從不同組織提取總RNA，并在1.5%變性瓊脂糖凝膠上電泳以測試完整性。使用Nanodrop ND-1000UV分光光度計(Nanodrop TM)測定RNA的數量和質量(Technologies，Wilmington，DE，USA)。

1.5實時熒光定量核酸擴增反應(qRT-PCR)

根據制造商的方案，使用QuantScript RT Kit(TIANGEN)進行cDNA合成，然后將cDNA儲存在-20℃下備用。三個重復的反應以總體積為25 μL進行，其中含有12.5 μL 2×SYBR Premix Ex Taq II(Perfect Real Time)(TaKaRa，Japan)、1.0 μL cDNA模板、0.8 μL 10 μmol·L-1每個正向和反向引物以及9.9 μL Milli-Q水。

PCR程序是：95℃進行5 min，然后是95℃持續10 s、退火溫度58℃持續20 s和72℃持續30 s的40個循環。在每次運行結束時，對PCR產物進行熔解曲線分析(60～95℃)，以確保單個產物被擴增。使用cDNA的稀釋系列監測每個引物對的擴增效率。所有放大效率在98%和101%之間。用比較Ct法2△△Ct法計算靶基因的相對表達，用β-actin標準化。采用SPSS 20.0對實驗所得數據進行單因素方差分析和Duncan氏多重檢驗(P<0.05)。

使用Primer Express 2.0軟件(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)并從Invitrogen公司合成所有引物(表1)。

表1 實驗所用引物

續表1

2 結果

如圖1所示，本文通過qRT-PCR技術分析10種體液、細胞和先天免疫相關的基因，觀察其在健康斜帶石斑魚不同組織中的免疫力。其中免疫球蛋白(IgM)、CD4和MHCIIa在鰓中的表達量最高，與其他組具有明顯的統計學差異(P<0.05)，在其他組織部位的表達量相對較少。TCR-β、CD8a和MHCIa也是在鰓中的表達量最高，在眼、肌肉、肝和腸的部位表達量相對較少。ISP16在鰓和肝中的表達量較高，在肌肉和腸中的表達量較低。Mx在鰓中的表達量較高，在肌肉和腸的表達量較低。TNFR14在眼的表達量較高，在腸的表達量較低。HSP90在鰓和肝中的表達量相對較高，在心和肌肉的表達量較低。

A：IgM mRNA； B：CD4 mRNA；C：MHCIIa mRNA；D：TCRβ mRNA ；E：CD8a mRNA；F：MHCIa mRNA；G：ISP16 mRNA ；H：Mx mRNA ；I：TNFR14 mRNA ；J：HSP90 mRNA

注：具有不同字母的值在0.05的顯著性水平上表示顯著差異(P<0.05)。

Note：Values with different letters represented significant difference at the significance level of 0.05(P<0.05).

3 討論

近年來受養殖密度不斷增大和水質污染的影響，斜帶石斑魚的病害明顯增多。斜帶石斑魚病害的防治，除了需要良好的養殖環境和藥物治療外，還需要提高魚體自身的免疫能力，特別對于與病毒相關的病害，更需要卓有成效的免疫防治。因此有必要進行與免疫相關的基礎研究。目前對斜帶石斑魚的基礎免疫學研究報道較少，所以本研究選用斜帶石斑魚為實驗對象，分析了10種免疫相關基因的轉錄表達，結果發現體液免疫相關基因[免疫球蛋白(IgM)、CD4和MHCIIa]的表達量在各組織中高低不一，在鰓中的表達量相對較高，在肌肉、肝和腸的表達量相對較低。這可能與鰓是斜帶石斑魚的呼吸器官，接觸水環境較多有關，且鰓是血液豐富的部位，所以體液免疫相關基因在鰓中的表達量相對較高。CD4、MHCIIa和某些免疫球蛋白通常用作體液免疫的標志物，IgM是腫瘤免疫的直接指標[12]。在本研究中，CD4、MHCIIa和IgM在鰓、頭腎和脾臟中均表現出大量的轉錄表達。當石斑魚、鱸魚和大西洋大比目魚患有β-亞麻病毒感染時，研究者發現IgM也大量表達[13-15]。所以可根據IgM在石斑魚抵抗病毒感染時會大量表達的現象來進行病害防御。鰓、頭腎和脾臟是表達IgM的活躍組織。

與體液免疫相似，細胞免疫在宿主抗病毒反應中起到重要作用。TCR-β是一種重要的T細胞標記，通常與CD8/MHCIa復合物配合以介導細胞毒性T淋巴細胞反應[16-18]。曾有研究報道感染期間TCR-β、CD8a和MHCIa的表達上調[19-23]，表明這些分子可能在抗病毒免疫中起重要作用。因此，本研究觀察到在鰓、頭腎、脾臟和心中，TCR-β、CD8a和MHCIa的相對表達量較高，表明這幾個部位可能是斜帶石斑魚抵抗病毒進行細胞免疫的主要器官。

通常，當脊椎動物遭受病毒感染時，干擾素信號通路首先被激活。在神經壞死病毒(NNV)感染斑馬魚的實驗中，干擾素途徑涉及急性和持續性感染[24]。Mx和ISP16是表現出抗病毒活性的干擾素途徑因子[25-26]。在甜菜堿病毒感染幾種魚類過程中觀察到Mx的mRNA表達量劇烈上調[27]。此外，注射干擾素可以拯救感染神經壞死病毒(NNV)的魚[24]。在本研究中，ISP16在心、鰓、脾臟和肝臟中的相對表達量較高，Mx在眼、心臟、頭腎、鰓、脾臟和肝臟中的表達量較高，TNFR14在眼和鰓中的表達量較高。表明當斜帶石斑魚遭受病毒感染時，干擾素途徑將會為這些組織器官提供保護。在斜帶石斑魚的應激過程中，一些病毒會引起熱休克反應，HSP90通常參與應激誘導的細胞保護作用[27]。在本研究中HSP90在多個組織中均有表達，在眼、鰓、鰭、肝和腸的表達量相對較高。多個研究報道說明當宿主感染病毒時HSP90會大量表達，表明HSP90在宿主體內抗病毒的重要作用[28-29]。

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mRNAexpressionoftenimmunegenesintissuesofEpinepheluscoioides

GEHui，LINKebing*，ZHOUChen，WUJianshao，ZHUZhihuang，LUZhen，ZHENGLeyun，WUShuiqing，LINQi，HUANGZhongchi

(Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian， Fisheries Research Institute of Fujian Province，Xiamen 361013，China)

In this study，β-actin mRNA expression was used as the internal reference，the mRNA expression of ten immune genes[(IgM)，CD4，MHCIIa，TCRβ，CD8a，MHCIa，ISP16，Mx，TNFR14，HSP90]were analyzed in tissues (head kidney，heart，liver，spleen，gill，muscle，fin，eye and intestine) ofEpinepheluscoioideswith quantitative Real-time PCR.The results showed that mRNA expressions of ten genes were observed in all of the above tissues.And the humoral immunity factors (IgM，CD4，MHCIIa) showed a highest expression in the gill，cellular immunity factors (TCR-β，CD8a and MHCIa) also showed a higher expression in the gill and lower in the eyes，muscles，liver and intestine.The expression of ISP16 in gill and liver was higher，and lower in muscle and intestine.TNFR14 in the eye was higher and the expression level in the intestine was lower.The expression of HSP90 in the gills and liver was relatively high，while the expression of HSP90 was lower in the heart and muscle.

Epinepheluscoioides；quantitative Real-time PCR；immune genes

S917.4

A

1006-5601(2017)05-0379-07