全自動固相萃取-超高效液相色譜法測定淡水養殖水體中的呋喃丹

(福建省海洋環境與漁業資源監測中心，福建 福州 350003)

2017-08-03

福建省科技計劃社會發展引導性(重點)項目(2016Y0004).

牛曰華(1981-)，男，工程師，主要從事水產品質量安全和漁業生態環境檢測.E-mail：yhniu99@126.com

牛曰華.全自動固相萃取-超高效液相色譜法測定淡水養殖水體中的呋喃丹[J].漁業研究，2017，39(5)：386-391.

全自動固相萃取-超高效液相色譜法測定淡水養殖水體中的呋喃丹

牛曰華

(福建省海洋環境與漁業資源監測中心，福建 福州 350003)

本文建立了淡水養殖水體中呋喃丹的全自動固相萃取-超高效液相色譜檢測方法。選取HLB固相萃取小柱作為水樣的富集和凈化小柱，水樣以5 mL·min-1的速度上樣，用10 mL甲醇洗脫。洗脫液經濃縮、定容后，采用超高效液相色譜-熒光檢測法分析，色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm × 2.1 mm，粒徑1.7 μm)，流動相為乙腈-水(40∶60，V/V)，流速為0.200 mL·min-1，激發波長為270 nm，發射波長為310 nm。呋喃丹在20～1 000 μg·L-1范圍內線性關系良好，相關系數R2> 0.999，方法檢出限為0.100 μg·L-1，定量限為0.250 μg·L-1，在0.250、2.50、10.0 μg·L-1三種加標濃度水平下，平均加標回收率為90.4%～96.3%，相對標準偏差為2.55%～5.10%。該方法自動化程度高、操作簡便、快速準確、穩定性好，適用于淡水養殖水體中呋喃丹的測定。

呋喃丹；超高效液相色譜；全自動固相萃取；淡水養殖水體

呋喃丹(Carbofuran，又名克百威)是一種氨基甲酸酯類殺蟲劑，屬高毒農藥，可在棉花、大豆和水稻等農作物上使用[1]。由于使用范圍較為廣泛，并且具有一定的水溶性，呋喃丹在農田土壤中殘留期較長，也可通過降水和地表徑流等途徑遷移至水體中，從而造成池塘、水庫等水體的污染。隨著工農業的發展，環境污染正逐漸成為影響食品安全的重要因素之一，為保證淡水養殖產地環境安全和農產品質量安全，NY/T 5361—2016《無公害農產品 淡水養殖產地環境條件》[2]增加了呋喃丹的檢測指標，規定其在淡水養殖水體中的最大限量值為0.01 mg·L-1。

目前呋喃丹的檢測方法主要有液相色譜-柱后衍生熒光檢測法[3-6]、液相色譜-紫外檢測法[7-12]、液相色譜串聯質譜法[13-16]、氣相色譜-質譜法[17]等。其中NY/T 5361—2016《無公害農產品 淡水養殖產地環境條件》中推薦的呋喃丹的檢測方法參照GB/T 5750.9—2006《生活飲用水標準檢驗方法 農藥指標》[18]的相關規定，該方法選用傳統的液液萃取方式進行提取，然后采用高效液相色譜-柱后衍生熒光檢測法進行測定，但液液萃取需要消耗大量的有機試劑，工作量較大，柱后衍生熒光檢測法需要專門配備柱后衍生裝置，操作較為繁瑣，結果的穩定性較差，同時所用衍生劑毒性較大。而其他的檢測方法中，液相色譜串聯質譜法和氣相色譜-質譜法檢測成本較高，液相色譜-紫外檢測法靈敏度較低。

全自動固相萃取操作簡便，自動化程度高，樣品前處理全程可以做到無人值守，可按照設定的程序自動完成固相萃取柱活化、樣品上樣、淋洗、洗脫和濃縮等工作，并能精確控制上樣速度、洗脫體積、氮吹溫度、氮氣流速等各種參數，從而減少手動操作帶來的誤差，并且縮短了樣品前處理時間，顯著提高了檢測結果的穩定性和檢測工作效率。熒光檢測器靈敏度高，適用于痕量分析。基于全自動固相萃取技術和熒光檢測器的上述優點，本文選用全自動固相萃取對養殖水體中的呋喃丹進行富集、凈化和濃縮，然后根據呋喃丹自身的熒光特征，用超高效液相色譜-熒光檢測法進行檢測。該方法樣品前處理自動化程度高，測定時無需柱后衍生操作，方法簡便快速，靈敏度和準確度較高，穩定性好，可有效滿足淡水養殖水體中呋喃丹的檢測要求。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

Waters H-CLASS超高效液相色譜儀，配熒光檢測器；Fotector-06C全自動固相萃取儀(廈門睿科儀器有限公司)；Milli-Q超純水系統(美國Millipore公司)；MS3渦旋混合器(德國IKA公司)；超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

呋喃丹標準品(100 μg·mL-1溶于甲醇)；甲醇、乙腈(色譜純，Merck公司)；Waters HLB固相萃取小柱(60 mg，3 mL)；Waters C18固相萃取小柱(500 mg，6 mL)。

1.2標準溶液的配制

移取適量的呋喃丹標準品，用乙腈-水(40∶60，V/V)溶液稀釋成濃度分別為20、50、100、250、500、1 000 μg·L-1的標準使用液，于冰箱中4℃保存。

1.3樣品前處理

量取200 mL經0.45 μm濾膜過濾的水樣，轉移至全自動固相萃取儀的進樣瓶中。將HLB小柱和洗脫液收集管分別安裝在全自動固相萃取儀上。儀器運行程序如表1所示，對水樣進行富集、凈化和濃縮，運行結束后，取出氮吹干的收集管，用1.00 mL流動相溶解，過0.22 μm濾膜后用超高效液相色譜檢測。

表1 全自動固相萃取程序

1.4色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm × 2.1 mm，粒徑1.7 μm)；流動相為乙腈-水(40∶60，V/V)，流速0.200 mL·min-1；柱溫40℃；進樣量10.0 μL；檢測波長：激發波長為270 nm，發射波長為310 nm。

2 結果與討論

2.1檢測器和檢測波長的選擇

紫外檢測器和熒光檢測器是液相色譜分析中常用的兩種檢測器。熒光檢測器選擇性較強，主要適用于在紫外光的照射下可以發出熒光物質，或者本身不發出熒光但經衍生后可以發出熒光物質。在對目標物質的檢測中，檢測器的靈敏度十分重要，熒光檢測器的靈敏度通常高于紫外檢測器。因此，在呋喃丹檢測中優先考慮使用熒光檢測器。在200～700 nm波長范圍內對呋喃丹進行激發光譜和發射光譜掃描，發現呋喃丹在270 nm處激發強度最大，在310 nm處發射強度最大。另外，通過對呋喃丹進行紫外光譜掃描，發現呋喃丹在210 nm附近有最大吸收，但其響應值僅為熒光檢測器(激發波長270 nm，發射波長310 nm)響應值的1/5，并且在210 nm波長附近存在較強的基質干擾。

因此本研究選擇用熒光檢測器進行檢測，選擇 270 nm作為激發波長，310 nm作為發射波長。

2.2流動相的選擇

對于反相色譜，最常用的流動相為乙腈-水和甲醇-水體系。本文考察了乙腈-水和甲醇-水體系下的呋喃丹的出峰情況，發現2種體系下呋喃丹峰形均良好。考慮到甲醇-水體系下液相系統壓力較高，因此選擇乙腈-水體系作為本研究的流動相。在流動相為乙腈-水(40∶60，V/V)、流速0.200 mL·min-1以及柱溫40℃條件下，呋喃丹保留時間約為3.7 min，與樣品基質分離完全，無干擾，保證了呋喃丹定性和定量的準確性。

2.3固相萃取柱的選擇

各取200 mL空白水樣，按照1.3的方法分別過HLB小柱和C18小柱，處理完成后上機檢測，考察2種小柱的凈化效果。結果表明，在呋喃丹出峰時間附近，2種小柱凈化后的樣品譜圖基線平穩，均無基質干擾。

往200 mL空白水樣中加入0.500 μg呋喃丹，此時水樣中呋喃丹的濃度為2.50 μg·L-1，以5 mL·min-1流速上樣，分別考察HLB小柱和C18小柱的加標回收率。結果發現，C18小柱的回收率在70%～85%之間，HLB小柱的回收率在88%～95%之間，HLB小柱的回收率明顯高于C18小柱。綜合樣品凈化效果和加標回收率，本文選擇HLB小柱作為水樣的富集和凈化小柱。

2.4水樣上樣速度的選擇

往200 mL空白水樣中加入0.500 μg呋喃丹，水樣過 HLB小柱，考察3種上樣速度(3、5、10 mL·min-1)下呋喃丹的回收率情況，結果如圖1所示。當上樣速度分別為3 mL·min-1和5 mL·min-1時，回收率均可穩定保持在85%以上，兩者無顯著性差異。當上樣速度為10 mL·min-1時，回收率約為67%，較上樣速度為3 mL·min-1和5 mL·min-1時的回收率明顯偏低。綜合加標回收率和樣品前處理效率，水樣的上樣速度設定為5 mL·min-1。

2.5線性范圍、檢出限和定量限

將配制的濃度為20、50、100、250、500、1 000 μg·L-1的呋喃丹標準溶液進樣分析，以峰面積(Y)為縱坐標、呋喃丹質量濃度(X，μg·L-1)為橫坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程：Y=1 270X+293，相關系數R2>0.999。由此可知，呋喃丹在20～1 000 μg·L-1范圍內線性關系良好。呋喃丹標樣色譜圖如圖2所示。

方法的檢出限和定量限通常分別按3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比所對應的樣品濃度來確定。往空白水樣中加入呋喃丹，當水樣中的呋喃丹濃度為0.100 μg·L-1時，按照本方法進行樣品處理和上機檢測，6份加標樣品在儀器上的響應值均能滿足S/N≥3。當空白加標水樣中的呋喃丹濃度為0.250 μg·L-1時， 6份加標樣品在儀器上的響應值均能滿足S/N≥10，回收率

在91.5%～103%之間，精密度為4.23%。由此確定方法的檢出限為0.100 μg·L-1，定量限為0.250 μg·L-1。

GB/T 5750.9—2006《生活飲用水標準檢驗方法 農藥指標》中呋喃丹的檢出限為0.125 μg·L-1，本方法的檢出限為0.100 μg·L-1，由此可以看出，兩種方法的檢出限較為接近。這表明本方法與柱后衍生熒光檢測法靈敏度差別不大，但本方法省去了柱后衍生的繁瑣操作，很大程度上提高了方法的簡便性和穩定性。本方法檢出限和定量限完全滿足NY/T 5361—2016《無公害農產品 淡水養殖產地環境條件》的要求。

2.6方法回收率和精密度

往空白水樣中添加不同量的呋喃丹，得到3個濃度梯度水平的加標樣品，含量分別為0.250、2.50、10.0 μg·L-1，每個濃度水平6份樣品。按照上述方法進行樣品處理和檢測，回收率和精密度結果如表2所示，呋喃丹的平均回收率在90.4%～96.3%之間，相對標準偏差在2.55%～5.10%之間。空白樣品和加標樣品的色譜圖如圖3和圖4所示。

表2 加標樣品的回收率和精密度

2.7實際樣品分析

對采自福建省南平、三明和寧德地區的45份無公害水產品產地的淡水養殖水樣和5份質控樣品(包括1份空白水樣和4份加標水樣)，同時按照本方法進行樣品處理和檢測。其中，45份養殖水樣均未檢出呋喃丹；5份質控樣品中，空白水樣未檢出呋喃丹，加標水樣均有檢出呋喃丹，回收率為88.5%～95.0%。質控結果滿足分析要求，這說明實際樣品的檢測結果準確可靠。檢測結果表明，上述無公害水產品產地的養殖水體的呋喃丹指標符合NY/T 5361—2016《無公害農產品 淡水養殖產地環境條件》的要求。

3 結論

本文采用全自動固相萃取技術對淡水養殖水體中的呋喃丹進行富集、凈化和濃縮，然后用超高效液相色譜-熒光檢測法進行測定。本方法樣品前處理自動化程度高，測定時無需進行柱后衍生操作，方法簡便、快速、準確，靈敏度高，穩定性好，適用于淡水養殖水體中呋喃丹的檢測。

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Determinationofcarbofuraninfreshwateraquaculturewaterbyultrahighperformanceliquidchromatographywithautomaticsolidphaseextraction

NIUYuehua

(Fujian Marine Environment and Fishery Resources Monitoring Center， Fuzhou 350003， China)

A new method was developed for the determination of carbofuran in freshwater aquaculture water by ultra high pressure liquid chromatography (UPLC) combined with automatic solid phase extraction (SPE). The water sample flowed through HLB SPE cartridge with a flow rate of 5 mL·min-1， and the analyte was eluted with 10 mL methanol in SPE cartridge. After concentrating and redissolving with acetonitrile-water (40∶60，V/V)， the eluent was analyzed by ultra high performance liquid chromatography with fluorescence detection. The analysis conditions were as the follows： chromatographic column was ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm)， mobile phase was acetonitrile-water (40∶60，V/V)， flow rate was 0.200 mL·min-1， excitation wavelength was 270 nm， emission wavelength was 310 nm. The correlation coefficients of carbofuran standard curve was more than 0.999 in the range of 20 ～ 1 000 μg·L-1. The limit of detection was 0.100 μg·L-1and the limit of quantitation was 0.250 μg·L-1. The average recoveries were in the range of 90.4% ～ 96.3% and the relative standard deviations were 2.55% ～ 5.10% at 0.250 μg·L-1， 2.50 μg·L-1and 10.0 μg·L-1spiked levels. The method was highly automated， simple， rapid， accurate and stable， and also suitable for the determination of carbofuran in freshwater aquaculture water.

carbofuran; ultra high performance liquid chromatography; automatic solid phase extraction; freshwater aquaculture water

O657.7

A

1006-5601(2017)05-0386-06