艾拉莫德對Ⅱ型膠原誘導性關節炎大鼠關節滑膜細胞核因子-κB信號的影響

黃 穎 姚血明 馬武開 唐 芳

(貴陽中醫學院第二附屬醫院風濕免疫科,貴州 貴陽 550001)

艾拉莫德對Ⅱ型膠原誘導性關節炎大鼠關節滑膜細胞核因子-κB信號的影響

黃 穎 姚血明 馬武開 唐 芳

(貴陽中醫學院第二附屬醫院風濕免疫科,貴州 貴陽 550001)

目的研究艾拉莫德(T-614)對Ⅱ型膠原誘導性關節炎(CIA)模型大鼠核因子(NF)-κB信號的影響。方法將40只大鼠隨機分成空白組，模型組，甲氨蝶呤(MTX)對照組，T-614治療組，每組10只。造模后，采用RT-PCR及Western印跡法檢測T-614對CIA大鼠關節滑膜細胞NF-κB/P50、NF-κB/P65、IκBα基因及蛋白水平的影響。結果T-614可下調CIA大鼠滑膜細胞NF-κB/P50、NF-κB/P65的表達，上調IκBα的表達，與模型組比較有統計學差異(P<0.01)；T-614治療組優于MTX對照組(P<0.01或P<0.05)。結論T-614可通過降低CIA大鼠關節滑膜細胞NF-κB/P50、NF-κB/P65表達，升高IκBα表達以達到控制關節炎的作用。

艾拉莫德(T-614)；Ⅱ型膠原誘導性關節炎；核因子-κB信號

類風濕關節炎(RA)發病始動機制至今仍不清楚，近年來研究發現，核因子(NF)-κB作為炎癥反應的關鍵信號傳導因子，在炎癥細胞因子介導的炎癥反應中起中心作用〔1，2〕，NF-κB信號通路的激活在RA發生發展過程中發揮重要作用〔3〕。艾拉莫德(T-614)作為我國完全自主知識產權的具有獨特作用機制的小分子抗風濕藥，相關臨床實驗證實其具有良好療效及安全性〔4〕，現已廣泛應用于RA的臨床治療。甲氨蝶呤(MTX)是一種改善病情的抗風濕藥物(DMARD)，是RA初始治療中的金標準藥物。相較于MTX起效慢、耐藥率逐漸升高，T-614在臨床使用中體現出相應的優勢。T-614主要作用機制之一是抗感染作用，本實驗通過建立Ⅱ型膠原誘導性關節炎(CIA)模型大鼠，研究T-614對 CIA 模型大鼠關節滑膜細胞NF-κB信號的影響，探討其在治療RA過程中減輕滑膜炎癥的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 6周齡40只健康清潔級雌性Wistar大鼠，體重(170±15)g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2主要試劑 牛Ⅱ型膠原(批號C7806-2)、弗氏完全佐劑(批號F5881)，美國Sigma公司；Trizol(批號15596-018)，Invitrogen公司；cDNA第一鏈合成試劑盒(批號#K1622)、SYBRGreen/FlouresceinqPCRMasterMix(2×)(批號#K0242)，Fermentas公司；Ex TaqTM(批號DRR100A)、DL2000 DNA Marker (批號D502A)，TAKARA公司；GAPDH抗體(批號AB-P-R 001)，杭州賢至生物有限公司；NF-κB P65抗體(批號8242)，美國CST公司；NF-κB P50抗體(批號ab7971)，abcam公司；IκBα抗體(批號10268-1-AP)、HRP標記羊抗兔二抗(批號BA1054)，武漢三鷹生物技術公司。艾拉莫德片，先聲藥業有限公司，批準文號：國藥準字H20110084；MTX，上海信誼藥廠有限公司，批準文號：國藥準字H31020644。

1.3動物分組 將大鼠隨機分為4組，每組10只，①空白組；②模型組；③T-614治療組；④MTX對照組。

1.4模型制備 按照參考文獻〔5〕將牛Ⅱ型膠原溶于0.1%冰醋酸中，按比例與弗氏完全佐劑1∶1充分混和乳化，于Wistar大鼠右后足跖肉墊內注射0.4 ml，第8天以相同乳劑級劑量于大鼠尾根部加強注射。空白組不予任何處理。

1.5給藥 從造模第1天開始用藥。T-614：10 mg/kg，1次/d，MTX：1 mg/kg，1次/w，給藥時將藥溶于2 ml生理鹽水內。空白組、模型組均灌胃2 ml生理鹽水。共給藥4 w。

1.6RT-PCR 取-80℃冰箱中保存的細胞，用Trizol法提取總RNA，測定OD260、OD280以及OD260/OD280值，計算RNA的純度和濃度，根據比值估測RNA質量，比值在1.8～2.0滿足實驗要求。將總RNA放于-80℃冰箱內保存以備用。用cDNA第一鏈合成試劑盒，按照試劑盒操作說明，用2.5 μl總RNA合成單鏈cDNA。然后取5 μl cDNA加入20 μl PCR反應體系中進行擴增，置于-20℃保留備用。反應條件：94℃ 4 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 25 s，30個循環；72℃ 4 min。RT-PCR引物序列:β-actin (240 bp)：前向：CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC，反向：TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT；Rat Nfkb(253 bp)：前向：GGCAGCACTCCTTATCAACC，反向：TAGAGGTGTCGTCCCATCGT；Rat IκBα(136 bp)：前向：ATGGCTACCTGGGCATCGTG，反向：TTCAACAGGAGCGAGACCAG。反應條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，共40個循環，反應結束后電腦自動分析計算結果。以β-actin 為內參，每個樣本重復測量3次，以2-△△CT進行分析，取3個樣本測定結果的平均值。

1.7Western印跡法 將滑膜組織加400 μl裂解液進行裂解、勻漿，提取核蛋白，避光孵育后測定OD值，計算樣品蛋白濃度。將樣品蛋白上樣于泳道中，導入電泳液進行電泳，在冰浴中電轉移至PVDF 膜，封閉2 h后，加入PBS浸泡，37℃孵育30 min，加入一抗孵育過夜。充分洗滌后加入二抗孵育2 h。再次充分洗滌后加酶，X線膠片壓片后，顯影、定影。沖洗、晾干、掃描膠片，用BandScan軟件分析膠片灰度值。

1.8統計學分析 采用SPSS22.0軟件，計量資料符合正態分布滿足方差齊性者采用單因素分析，不符合采用非參數(秩和)檢驗。

2 結 果

2.1T-614對CIA大鼠關節滑膜細胞NF-κB、IκBα mRNA表達的影響 與空白組相比，模型組NF-κB表達升高(P<0.01)；與模型組相比，T-614治療組NF-κB表達下降(P<0.01)；與MTX對照組相比，T-614治療組具有統計學差異(P<0.05)。與空白組相比，模型組IκBα表達下降(P<0.01)；與模型組相比，T-614治療組IκBα表達有不同程度上升(P<0.01)；與MTX對照組相比，T-614治療組具有統計學差異(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠滑膜組織中NF-κB、IκBα基因表達

與空白組相比:1)P<0.01；與模型組相比:2)P<0.01；與MTX對照組相比:3)P<0.05

2.2T-614對NF-κB信號蛋白水平的調控 與空白組相比，模型組NF-κB/P65、NF-κB/P50蛋白灰度值明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，T-614治療組NF-κB/P65、NF-κB/P50蛋白灰度比值不同程度下降(P<0.01)；與MTX對照組相比，T-614治療組具有統計學差異(P<0.01或P<0.05)。與空白組相比，模型組IκBα蛋白灰度比值下降(P<0.01)；與模型組相比，T-614治療組IκBα蛋白灰度比值上升(P<0.01)；與MTX對照組相比，T-614治療組具有統計學差異(P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠滑膜組織中NF-κB、IκBα蛋白表達

與空白對照組相比：1)P<0.01；與模型對照組相比：2)P<0.01；與MTX對照組相比：3)P<0.05，4)P<0.01

3 討 論

RA是臨床最常見的自身免疫性疾病，具有發病率高、致殘率高的特點，嚴重影響人類健康，其發病與免疫功能異常密切相關〔6，7〕。NF-κB普遍存在于真核細胞內，是介導許多免疫和炎癥反應的中心物質，參與多種相關基因的轉錄調控而發揮作用〔8，9〕。在RA 的滑膜細胞中，免疫活性NF-κB蛋白P50和P65大量表達，與其調控的細胞因子一起積極參與了關節炎癥及損傷反應等病理進程，在RA的發病中起關鍵作用〔10，11〕。當細胞處于靜息狀態時，NF-κB與其抑制蛋白IκB形成復合物，以無活性的形式存在于胞質中〔12〕，IκB功能主要是對NF-κB的活化起抑制作用。當細胞受到細胞外信號如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1、脂多糖(LPS) 、氧自由基等〔13〕刺激時，可通過降解IκB而激活NF-κB，并很快啟動基因轉錄和蛋白合成〔14〕。活化的NF-κB增強很多炎癥介質，如TNF-α、IL-1β等的表達，而TNF-α、IL-1β等又可進一步激活NF-ΚB的表達，兩者構成正反饋機制，導致RA關節炎癥及關節結構破壞得以維持與進展〔15，16〕。因此，阻斷RA患者病理狀態下NF-κB的活化，可以阻斷疾病的發展。本課題研究提示，NF-κB可能與CIA模型鼠關節滑膜炎癥的發生發展密切相關。T-614是一種新型的具有多作用靶點的緩解病情類藥物，屬甲磺酸苯胺族中的一員，這個家族中大部分成員主要表現為對環氧化酶(COX)-2的抑制作用，但越來越多的相關研究已證明T-614具備與眾不同的免疫調節作用。本次實驗發現T-614及MTX均可下調CIA模型鼠關節滑膜NF-κB表達，上調抑制蛋白IκBα的表達，在同一時間點，T-614作用優于MTX，提示T-614可能通過靶向調控NF-κB信號表達，抑制NF-κB信號通絡的活化，下調相關炎癥細胞因子的水平，從而發揮治療RA的作用。結合目前對于T-614的諸多臨床研究，對于MTX治療效果不佳或副作用不能耐受的患者，T-614將成為一種更好的選擇。

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TheeffectofT-614〔N-(3-formylamino-4-oxo-6-phenoxy-4H-chromen-7-yl)methanesulfonamideonnuclearfactor-κBsignalofarticularsynovialcellsincollageninducedarthritismodelrats

HUANGYing,YAOXue-Ming,MAWu-Kai,etal.

DepartmentofRheumatologyandImmunology,theSecondAffiliatedHospitalofGuiyangUniversityofChineseMedicine,Guiyang550001,Guizhou,China

ObjectiveTo study the effect of T-614〔N-(3-formylamino-4-oxo-6-phenoxy-4H-chromen-7-yl) methanesulfonamide on nuclear factor (NF)-κB signal of articular synovial cells in collagen induced arthritis (CIA) model rats.Methods40 rats were randomly divided into blank control,model control, methotrexate (MTX), T-614 treatment groups, each group with 10 rats.RT-PCR and Western blot were used to detect the expressions of NF-κB/P50, NF-κB/P65, IκBα in each group.ResultsT-614 down-regulated the expressions of NF-κB/P65 and NF-κB/P50,up-regulated the expression of IκBα in articular synovial cells of CIA rats(P<0.01);the effects in T-614 treatment group were better than those of MTX control group(P<0.01 orP<0.05).ConclusionsT-614 could lower the expressions of NF-κB/P50 and NF-κB/P65,upregulate the expression of IκBα in articular synovial cells of CIA rats,through these ways,it could control arthritis.

T-614;Collagen induced arthritis;Nuclear factor-κB signal

國家自然科學基金資助項目(81460727)；貴州省社會攻關項目(黔科合SY字(2013)3048號)；貴州省科技合作計劃項目(黔科合LH字〔2015〕7259號)

姚血明(1984-)，男，副主任醫師，主要從事中西醫結合防治風濕免疫病研究。

黃 穎(1982-)，女，主治醫師，主要從事中西醫結合防治風濕免疫病研究。

R6

A

1005-9202(2017)20-4964-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.004

〔2016-11-19修回〕

(編輯 李相軍)