硫化氫通過下調MMP-11和MMP-16改善高甲狀腺素誘導的大鼠心肌纖維化

劉盛權 李 琳 龍俊蓉 譚文婷 唐 芬 劉茂軍 梁 彪 李子寧 褚 春 楊 軍

(南華大學附屬第一醫院心內科，湖南 衡陽 421001)

1 南華大學附屬第二醫院藥劑科

硫化氫通過下調MMP-11和MMP-16改善高甲狀腺素誘導的大鼠心肌纖維化

劉盛權 李 琳 龍俊蓉 譚文婷 唐 芬 劉茂軍 梁 彪 李子寧 褚 春1楊 軍

(南華大學附屬第一醫院心內科，湖南 衡陽 421001)

目的觀察硫化氫(H2S)對甲狀腺激素誘導的甲狀腺功能亢進大鼠心肌纖維化的影響。方法通過左旋甲狀腺素溶液(L-Thy，250 μg/ml)腹腔注射(10 ml·kg-1·d-1)4 w，建立甲狀腺功能亢進大鼠模型。以硫氫化鈉(NaHS)作為外源性H2S供體，隨機將40只SD雄性大鼠等分為對照組(Control組)、模型組(L-Thy組)、H2S干預組(L-Thy+H2S組)和H2S對照組(H2S組)，4 w后處死大鼠，取左室心肌組織行Masson染色觀察心肌纖維化，測量膠原容積分數(CVF)，Western印跡檢測MMP-11、MMP-16、PKCα靶蛋白的表達。結果與Control組相比，L-Thy組心肌膠原纖維堆積明顯增加，CVF增高(P<0.05)，而與L-Thy組相比，L-Thy+H2S組纖維化得到明顯改善，CVF降低(P<0.05)；H2S組與Control組鏡下改變類似，CVF無明顯差異(P>0.05)；與Control組相比，L-Thy組MMP-11、MMP-16表達有顯著差異(P<0.05)；與L-Thy組相比，L-Thy+H2S組MMP-11、MMP-16表達明顯減低(P<0.05)，H2S組與Control組上述蛋白表達水平無明顯差異(P>0.05)。各組之間PKCα蛋白表達沒有明顯差異(P>0.05)。結論H2S可改善甲狀腺激素誘導的甲狀腺功能亢進大鼠心肌纖維化，其機制可能與下調MMP-11、MMP-16表達有關，但與PKCα通路無關。

甲狀腺功能亢進；心肌纖維化；H2S；MMP-11、MMP-16；PKCα

心肌重構及心肌纖維化是甲亢性心臟病主要的病理變化，其機制與甲狀腺激素引起的心肌細胞代謝加速、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)激活、交感-迷走神經張力失衡及心肌組織間炎性細胞浸潤、水腫、壞死、氧化應激等有關〔1〕。心肌纖維化是多種病理因素作用下心肌間質成纖維細胞過度增殖、膠原沉積異常增加所致心肌結構與功能重構，其機制與細胞外基質的合成與降解失衡有關〔2〕。基質金屬蛋白酶(MMPs)具有降解多種細胞外基質的生物活性并可導致瀑布效應，是心肌纖維化進程中的主要參與者。硫化氫(H2S)可清除氧自由基及硝基自由基，改善氧化應激損傷，目前許多研究發現其具有一定的心臟保護作用〔3〕，但H2S可否改善過量甲狀腺激素作用下的心肌纖維化以及是否通過調控蛋白激酶C(PKC)α信號通路發揮作用，目前尚無相關文獻報道。本研究擬探索H2S對過量甲狀腺激素作用下心肌纖維化的影響及其調控機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 40只雄性SD大鼠(200±10)g，購于南華大學實驗動物中心，均分籠飼養在恒溫(23±1)℃環境下，采用人工照明(晝夜交替)12 h，均可自由獲得糧食和水。

1.1.2實驗試劑 左旋甲狀腺素粉劑(L-Thy)和硫氫化鈉(NaHS，H2S 供體)均購自Sigma公司；MMP-11、MMP-16和PKCα一抗以及羊抗兔二抗均購自武漢博士德公司；鼠源GAPDH 一抗購自晶欣生物公司；BCA 蛋白定量試劑盒、Masson染色試劑盒及細胞裂解液均由碧云天公司提供；電泳槽(儀)、轉膜儀均購自Bio-Rad公司(美國)。

1.2方法

1.2.1模型建立及處理方案 所有參與實驗的大鼠均適應性飼養1 w，此后，將40只SD大鼠隨機等分為4組：對照組(Control 組)、模型組(L-Thy組)、H2S干預組(L-Thy+H2S組)和H2S對照組(H2S組)，予L-Thy(以生理鹽水溶解，250 μg/ml)腹腔注射(10 ml·kg-1·d-1)4 w，建立甲亢大鼠模型；L-Thy+H2S組及H2S組每日同時予以NaHS溶液(100 μmol/kg)腹腔注射〔4〕。Control組予腹腔注射等量的生理鹽水，4 w后處死并開胸取出大鼠心臟后，以 0.9%生理鹽水(4℃)反復沖洗，剪去游離心肌組織，剝離后僅留左室及室間隔，取部分組織用甲醛固定，石蠟包埋，備用于Masson染色。所剩心肌組織置于-80℃保存，行Western印跡檢測。

1.2.2Masson染色觀察心肌纖維化〔5〕大鼠心肌組織以甲醛浸潤固定，常規石蠟包埋，繼之脫水，制成切片(4 μm)，Masson染色，光鏡下觀察心肌組織膠原纖維堆積情況，鏡下膠原纖維被染成深藍色，胞核呈藍褐色，胞質呈紅色，共取不包含血管的5個不同視野，采用IPP6.0圖像分析軟件進行分析處理，測量每組大鼠膠原纖維容積分數(CVF)。

1.2.3Western印跡檢測心肌組織中MMP-11、MMP-16及PKCα蛋白的表達水平 取大鼠組織標本，經稱量、研磨及提取總蛋白后采用BCA比色法定量，蛋白標本常規電泳、轉膜、封閉、一抗孵育24 h(4℃)，繼之用TBST溶液漂洗3次(每次10 min)，再以HRP 標記的二抗(稀釋比例為1∶2 000)孵育1 h(37℃)，再次以TBST溶液漂洗3次(每次10 min)，ECL顯影，曝光掃描，采用Image J軟件對靶蛋白條帶進行光密度分析，以相應條帶與內參GAPDH灰度比值表示MMP-11、MMP-16、PKCα靶蛋白相對表達水平。

1.3統計學方法 采用SPSS18.0軟件，計量資料行方差齊性檢驗，多組間均數比較行單因素方差分析(ANOVA)。

2 結 果

2.1大鼠存活情況 4 w后，有32只大鼠存活，其中Control組9只，L-Thy組7只，L-Thy+H2S組8只，H2S組8只。

2.2大鼠心肌組織Masson 染色 與Control 組相比，L-Thy組大鼠心肌細胞間大量的藍色深染的膠原纖維堆積，CVF明顯增加(P<0.05)；而與L-Thy組相比，L-Thy + H2S 組大鼠心肌細胞間膠原纖維明顯減少，CVF顯著減少(P<0.05)。Control 組與H2S組之間鏡下膠原纖維沉積類似，CVF未見明顯差異(P>0.05)，見圖1。

2.3H2S對心肌組織中MMP-11、MMP-16及PKCα蛋白表達的影響 與Control 組相比，L-Thy組MMP-11、MMP-16蛋白表達明顯增高(P<0.05)；與L-Thy組相比，L-Thy+H2S組MMP-11、MMP-16蛋白表達明顯下調(P<0.05)；Control 組與H2S組之間MMP-11、MMP-16蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。各組之間PKCα蛋白表達未見明顯差異(P>0.05)，見圖2，表1。

圖1 各組大鼠心肌組織Masson染色(×400)

圖2 各組大鼠MMP-11、MMP-16及PKCα蛋白表達

組別MMP?11MMP?16PKCαCVFControl組0．718±0．0180．693±0．0430．580±0．0070．026±0．0003L?Thy組0．968±0．1111)1．009±0．0091)0．585±0．0080．128±0．00251)L?Thy+H2S組0．701±0．0162)0．649±0．0472)0．553±0．0080．083±0．00342)H2S組0．705±0．0040．731±0．0150．576±0．0140．033±0．0033

與Control組比較：1)P<0.05；與L-Thy組比較：2)P<0.05

3 討 論

高甲狀腺素作用于心臟引起的病理改變主要是心肌纖維化，后者是甲亢性心臟病發展到心肌重構和心功能不全的主要因素，而目前針對心肌纖維化的有效治療策略相當有限。心肌纖維化是心肌細胞外基質(ECM)進行重塑的結果，主要與膠原的合成與降解失衡有關。MMPs是一組鋅離子依賴性內肽酶，因其具有降解多種細胞外基質并形成瀑布效應的生物活性，故成為心肌纖維化進程中的主要參與者。當MMPs表達異常時導致ECM降解失衡，其在很大程度上推動了心肌纖維化的進展，目前許多研究也發現在心肌纖維化組織中，MMPs蛋白表達明顯增加。MMP-11又稱為基質裂解素-3，在正常的器官組織中其低表達甚至不表達，反之，則高表達，能下調體內的纖連蛋白，參與細胞凋亡及ECM重構〔6，7〕。MMP-16也稱為模型基質金屬蛋白酶(MT-MMP)，能特異性激活下游的MMP-2，而MMP-2屬于明膠酶，既能分解變性膠原明膠，亦可分解Ⅳ、Ⅴ和Ⅶ型膠原以及纖維連接蛋白等，從而參與纖維化的進程〔8〕。本研究結果顯示，過量的甲狀腺激素引起了心肌纖維化，同時，高甲狀腺素誘導下可導致明顯大鼠心肌纖維化，并與MMP-11、MMP-16水平明顯上調有關。PKC是絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶家族中的一員，具有多種亞型，而PKCα為蛋白激酶家族表達最豐富的亞型(屬于經典型)，參與細胞炎癥反應、增殖與凋亡、氧化應激等的調控〔9〕。PKC也參與調節MMPs 的水平和活性的調控。Song等〔10〕發現在大鼠心衰模型中PKCα表達上調，促進心肌纖維化發生。但PKC 在纖維化信號轉導通路中的作用極其復雜，即使是同一種亞型的PKC在不同心臟疾病中也具有不同的作用，如PKCε激活在高血壓誘導的心功能不全的發生機制中顯示損害作用，卻在心肌梗死模型中具有保護作用〔11〕。本研究也提示，PKCα通路可能沒有參與高甲狀腺素誘導的大鼠心肌纖維化的調控機制。

有研究表明，內源性或者一定濃度的外源性的H2S具有抗炎、舒張血管、促進血管平滑肌細胞凋亡和抗氧化應激等多種生物學效應，在心腦血管疾病保護中有一定作用；外源性的H2S能抑制促纖維化基因及Galectin-3 mRNA 表達水平，降低纖維化指標CTGF〔12〕。eNOS調控NO的合成是心血管保護的關鍵，而H2S通過調節eNOS活化及使NO生物利用度增加，在調節細胞代謝、減輕纖維化及炎癥反應等方面延緩心肌纖維化及心功能不全的發生與發展〔13〕。本研究提示H2S可改善甲亢性心肌纖維化。H2S干預可通過下調MMP-11和MMP-16水平改善高甲狀腺素誘導的大鼠心肌纖維化。有學者發現H2S能夠調控PKCα、磷脂酰激酶-3(PI3K)及細胞外調節蛋白激酶(ERK)等信號轉導分子，改善心肌缺血缺氧時的炎癥反應、凋亡及氧化應激，從而改善心功能及心肌纖維化〔14〕；而H2S的心肌保護作用也與下調PKC的表達有關。本研究發現，H2S下調MMP-11和MMP-16水平以及改善大鼠心肌纖維化的機制可能與調控PKCα通路無關。本研究結果為防治甲亢性心肌病以及高甲狀腺素誘導的心肌纖維化提供了新的治療靶點及新的思路，但其具體的調控機制及信號轉導通路仍需進一步研究。

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Hydrogensulfideattenuatingmyocardialfibrosisinducedbyhighthyroidhormonethroughdown-regulatingtheexpressionsofMMP-11andMMP-16inratmodels

LIUSheng-Quan,LILin,LONGJun-Rong,etal.

DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofUniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China

ObjectiveTo observe the effects of Hydrogen sulfide (H2S) on myocardial fibrosis in rat models of hyperthyroidism induced by high thyroid hormone.MethodsThe hyperthyroidism in rats were induced by intraperitoneal injection of the L-Thyroxine solution (250 μg/ml,10 ml·kg-1·d-1) for 28 days. Sodium hydrosulfide was taken as the exogenous donor of hydrogen sulfide.40 male SD mice were randomly divided into control， model， intervention of H2S(L-Thyroxine+H2S group)and control of H2S(H2S group)groups. All the mice were killed after 4 weeks, then Masson staining was performed to observe the myocardial fibrosis and the collagen volume fraction(CVF) was measured, the expression of MMP-11， MMP-16 and PKCα was detected by Western blot.ResultsCompared with control group, the myocardial fibrosis and CVF were obviously increased in the L-Thyroxine group (P<0.05). Compared with L-Thyroxine group, the myocardial fibrosis and CVF were significantly decreased in L-Thyroxine+H2S group (P<0.05), and there was no difference between control and H2S groups (P>0.05). Compared to control group, the expression of MMP-11 and MMP-16 were up-regulated in L-Thyroxine group (P<0.05), while the expression of above target proteins were down-regulated obviously in L-Thyroxine+H2S group (P<0.05), there was still no difference between control group and H2S group (P>0.05). Also, the expression of PKCα was similar in each group (P>0.05).ConclusionsThe H2S may improve the rats myocardial fibrosis of hyperthyroidism induced by thyroid hormone through regulating the expression of protein of MMP-11, MMP-16 but has nothing to do with the pathway of PKCα.

Hyperthyroidism；Myocardial fibrosis；H2S；MMP-11;MMP-16;PKCα

國家自然科學基金(81270181；81202830)

楊 軍(1972-)，男，博士，教授，主任醫師，碩士生導師，主要從事老年心血管疾病研究。

劉盛權(1992-)，男，在讀碩士，主要從事心血管疾病及老年醫學研究。

R581.1

A

1005-9202(2017)20-4985-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.013

〔2017-01-15修回〕

(編輯 李相軍)