大鼠骨髓單核細胞移植對潰瘍性結腸炎模型大鼠的修復作用

韓宇鵬 鮑秀琦 顏 玉 陳 剛 邱 冰 吳 宇 王 雪 姜 威

(佳木斯大學附屬第一醫院， 黑龍江 佳木斯 154007)

大鼠骨髓單核細胞移植對潰瘍性結腸炎模型大鼠的修復作用

韓宇鵬 鮑秀琦 顏 玉 陳 剛 邱 冰 吳 宇 王 雪 姜 威

(佳木斯大學附屬第一醫院， 黑龍江 佳木斯 154007)

目的探討骨髓單核細胞(BM-MNCs)移植對潰瘍性結腸炎(UC)的修復作用。方法將標記的異體大鼠BM-MNCs移植到大鼠UC模型內，觀察大鼠的精神、進食、活動、大便情況及體重變化，結腸大體形態，黏膜組織損傷的情況。結果移植7 d后大鼠的一般情況、體重、排便情況明顯優于磷酸鹽緩沖液(PBS)組；大鼠結腸組織大體及光鏡觀察，移植后3 d及7 d，移植組與PBS組結腸大體標本無明顯差別，移植后14 d，移植組結腸大體標本可見黏膜充血、水腫、糜爛、無明顯潰瘍；熒光顯微鏡觀察，移植14 d的大鼠結腸組織中均可觀察到DAPI標記的BM-MNCs細胞。結論BM-MNCs移植可以促進大鼠UC模型損傷結腸組織的修復。

骨髓單個核細胞；移植；潰瘍性結腸炎

目前，潰瘍性結腸炎(UC)的治療方法主要有藥物誘導緩解、藥物維持及外科手術，但具有一定的副作用和并發癥。骨髓單個核細胞(BM-MNCs)是成體組織干細胞，不僅具有組織的自我更新和細胞的定向分化潛能，又能產生一些可促進神經、血管再生的細胞因子，包括造血干細胞、骨髓間充質干細胞和內皮祖細胞等〔1〕。近年來，大量的實驗研究〔2～12〕結果表明BM-MNCs可借助于受損部位的細胞因子、黏附因子等的趨化作用，向病變部位遷移，實現其向損傷組織的定植和歸巢。本實驗旨在研究BM-MNCs的培養及BM-MNCs對UC的治療效果。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級健康成年雄性SD大鼠54只，體重(250±10)g，6～8周齡，購自哈爾濱醫科大學實驗動物學部；三硝基苯磺酸、弗氏完全佐劑均購自美國sigma公司；水合氯醛購自天津大茂化學制劑廠；DAPI購自北京華邁科世紀公司。

1.2方法

1.2.1分組 36只大鼠采用免疫復合法制備UC模型后，隨機分為BM-MNCs移植組及磷酸鹽緩沖液(PBS)組，每組18只，余18只用于提取BM-MNCs。

1.2.2制備家兔結腸黏膜抗原 剝離家兔的結腸并分離黏膜層，加入十二烷基硫酸鈉(SDS)裂解液，低溫研磨黏膜層組織成組織勻漿液， 95℃作用5 min，可將蛋白酶從組織勻漿液中去除，4℃，15 000 r/min離心10 min后，留取上清液轉入透析袋中，為了去除上清液中SDS，將透析袋逐步浸入梯度濃度的生理鹽水中。采用雙縮脲法測定蛋白后，取蛋白含量為20 mg/ml上清液與等體積弗氏完全佐劑充分混合，制備家兔抗原乳化液備用。

1.2.3提取BM-MNCs 緩慢腹腔注射10%水合氯醛溶液，麻醉SD大鼠，待其完全麻醉后用剪刀將腿部皮膚備皮，浸入75%酒精，消毒3～5 min。清除肌肉、筋膜后充分暴露股骨和脛骨并取出關節，分離股骨和脛骨兩端骨皮質并在骨骺處注入5 ml抗凝液，反復沖洗骨髓腔，收集骨髓液至離心管中，4℃，1 500 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀中加入2 ml PBS液后充分渦旋混合，重復低溫離心。將骨髓液緩慢傾覆于等體積的淋巴細胞分離液上層，混合液4℃，2 000 r/min離心15 min，棄除上清液，留取白色細胞層4℃保存。

1.2.4DAPI標記BM-MNCs 用含DAPI(終濃度為50 μg/ml)的DIEM培養基重懸細胞，于含5%CO2飽和濕度、37℃培養箱中染色2 h，收集細胞并計數。

1.2.5制備UC模型及BM-MNCs靜脈移植 第1、14天時，將0.4 ml抗原乳化劑充分渦旋，混勻后緩慢注射大鼠腹股溝及足跖處，且末次注射后24 h內需要給予大鼠禁食但不禁水，緩慢腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，將硅膠管(直徑0.2 cm×長度15 cm)液體石蠟潤滑，輕柔插入肛門內約8 cm，然后緩慢推注含有100 mg TNBS/kg+50%乙醇的灌注液，灌注后不僅保持身體平躺且臀部要抬高至自然清醒。UC模型成模24 h后，分別給予移植組大鼠經尾靜脈注射1 ml BM-MNCs細胞懸液(3×106個/ml)；PBS組注入相同體積的PBS溶液。

1.2.6觀察一般情況 UC大鼠移植BM-MNCs后，進行常規飼養，溫度與濕度均適宜，每天觀察各組大鼠的精神狀態、食欲和食量情況、日常活動、毛發光澤度、大便次數和性狀等情況并記錄。分別于移植后的3、7、14 d每組隨機抽取6只大鼠麻醉后處死，剖取其結腸并小心縱行剪開，經PBS沖洗干凈后，觀察大鼠的結腸組織的組織學和病理學變化和結腸表面黏膜層的損傷情況。

1.2.7熒光顯微鏡觀察BM-MNCs分布 避光取已固定的移植組結腸組織塊經冰凍切片包埋劑包埋后制作冰凍切片(20 μm)。部分切片待風干后加熒光淬滅劑，封片。熒光顯微鏡下觀察結腸組織中并拍照，細胞核呈藍色熒光，即為DAPI標記的BM-MNCs。

1.3統計學方法 應用SPSS21.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1一般情況 兩組大鼠于造模1 d后，均開始出現食欲不振甚至厭食，背部拱起活動減少，肛門處可見暗紅色、黑色黏稠樣稀便，體重減輕。造模3 d后，出現UC的典型臨床癥狀，大鼠形體消瘦，表情淡漠精神不振，毛發枯干無光亮，懶動，大便次數減少，褐色伴有膿汁為黏稠樣的稀便，有腥惡臭味，體重減輕明顯。移植組大鼠7 d后，一般狀況有所改善，精神活動狀態有好轉，食欲漸強及體質量增加，但肛周仍有少量的稀樣便；PBS組臨床癥狀無變化，但腹圍增加，體重減輕。移植后的第6天有1只SD大鼠死亡。移植組大鼠14 d后，一般精神活動狀態良好，喜動、毛色有光澤，進食量和體質量明顯增加，仍排有稀便但無膿血；PBS組大鼠進食量較前稍有增加，其他癥狀改善不明顯，腹圍明顯增大，體質量略有增加。 其中有1只SD大鼠在移植后9 d死亡。經過BM-MNCs移植治療后，兩組大鼠體質量變化百分比有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2結腸黏膜組織形態學觀察 移植3 d后，兩組大鼠結腸回盲部結腸擴張，距離肛周13 cm內的結腸黏膜有廣泛的腫脹充血、組織糜爛甚至壞死，同時還可見直徑0.5～1 cm的潰瘍灶存在。移植7 d后，兩組大鼠均表現結腸回盲部的管腔較前明顯擴張，結腸在距離肛周7～11 cm處與腸壁明顯增厚，皺襞消失，質地脆，和周圍的組織可形成明顯的組織粘連及包裹，結腸的黏膜層出現廣泛的水腫、充血、組織糜爛和壞死等病變，并可見不同程度的潰瘍。移植14 d后，移植組大鼠表現為結腸回盲部的管腔稍有縮窄，腸組織與周圍組織粘連不明顯，但結腸的黏膜層仍有水腫、充血，組織糜爛、未見明顯潰瘍，并可見局部瘢痕增生；PBS組大鼠回盲部的結腸管腔表現明顯擴張，部分可見巨結腸，結腸在距離肛周7～13 cm處與周圍的組織形成廣泛的粘連、包裹，結腸黏膜層廣泛而明顯的水腫、充血、組織糜爛及壞死。見圖1。

表1 兩組移植后大鼠體重變化

與PBS組比較：1)P<0.05

圖1 大鼠結腸黏膜形態學觀察(×10)

2.3BM-MNCs在大鼠結腸分布 DAPI標記細胞的細胞核呈藍綠色熒光，觀察在移植后14 d組的大鼠結腸組織中可見，被標記的細胞主要分布在結腸黏膜層及黏膜下層，而肌層未見分布。見圖2。

圖2 移植14 d后DAPI標記的BM-MNCs在大鼠結腸分布(×100)

3 討 論

UC是由遺傳、環境、免疫調節間復雜的相互作用等多個因素共同導致、嚴重威脅病人健康的炎癥性腸病(IBD)。傳統的UC治療一直是醫學的難題之一〔2〕。

本實驗成功在大鼠體內提取了BM-MNCs，其成活率可達95%，熒光顯微鏡觀察，結果與Hayashi等〔5〕與和Wei等〔13〕的研究結果一致，表明BM-MNCs細胞可遷移和定植于損傷的結腸組織中。本實驗顯示在移植初期，BM-MNCs移植組大鼠的體重會出現短暫降低，隨后體重逐漸恢復；而PBS組大鼠的體重呈持續、急劇降低，結果與Hayashi等〔5〕通過BMSCs移植治療UC大鼠的實驗結果相一致。

雖然BM-MNCs移植療法治療UC效果顯著，較傳統治療手段有著明顯的優越性，但是目前BM-MNCs移植對IBD的治療還處于理論研究和臨床試驗階段。

1Vulliet PR,Greeley M,Halloran SM,etal.Intracoronary arterial injection of stromal cell and microinfarction in dogs〔J〕.Lancet,2012;363 (9411):783-4.

2Lopez CSO,Sullivan KM,McDomald GB.Course of cecropsdisease after allogeneic marrow transplantation〔J〕.Gastroenterology,1998;114(3):433-40.

3Wu Y,Wang J,Scott PG,etal.Bone marrow-derived stem cells inwound healing:a review〔J〕.Wound Repair Regen,2007;15(Suppl 1):18-26.

4Kuo TK,Hung SP,Chuang CH.etal.Stem cell therapy for liver disease:parameters governing the success of using bone marrowmesenchymal stemcells〔J〕.Gastroenterology,2008;134(7):2111-21.

5Hayashi Y,Tsuji S,Tsuji M,etal.Topical implantation of mes-enchymal stem cells has beneficial effects on healing of experimental colitis in rats〔J〕.J Pharmacol Exp Ther,2008;326(2):523-31.

6Wei YM,Nie YQ,Lai JY,etal.Comparison of the population caopacity of hematopoietic and mesenchymal stem cells in experimental colitis rat model〔J〕.Transplantation,2009;88(1):42-8.

7Nishida T,Tsuji S,Tsuji M,etal.Cultured bone marrow cell local implantation accelerates healing of ulcers in mice〔J〕.J Gastroenterol,2008;43(2):124-35.

8Ryan JM,Barry F,Murphy JM,etal.Interferon-gamma does not break,but promotes the immunosuppressive capacity of adult human mesenchymal stem cells〔J〕.Clin Exp Immunol,2007;149:353-63.

9Bamba S,Lee CY,Brittan M,etal.Bone marrow transplantation ameliorates pathology in interleukin-10 knockout colitic mice〔J〕.J Pathol,2006;209(2):265-73.

10Brittan M,Chance V,Elia G,etal.A regenerative role for bone marrow following experimental colitis:contribution to neovasculogenesis and myofibroblasts〔J〕.Gastroenterology,2005;128:1984-95.

11Khalil PN,Weiler V,Nelson PJ,etal.Nonmyeloablative stem cell therapy enhances microcirculation and tissue regeneration in murine inflammatory bowel disease〔J〕.Gastroenterology,2007;132:944-54.

12Sato Y,Araki H,Kato J,etal.Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver are differentiated into humanhepatocytes without fusion〔J〕.Blood,2005;106:756-63.

13Wei YM,Nie YQ,Lai JY.etal.Comparison of the population caopacity of hematopoietic and mesenchymal stem cells in experimental colitis rat model〔J〕.Transplantation,2009;88(1):42-8.

黑龍江省自然科學基金項目(H201367)；黑龍江省衛生廳科研項目(2013245)；黑龍江省大學生創新創業訓練計劃項目(201610222023)

姜 威(1977-)，男，副主任醫師，碩士生導師，主要從事潰瘍性結腸炎的基礎與臨床研究。

韓宇鵬(1982-)，男，主治醫師，碩士，主要從事潰瘍性結腸炎的臨床研究。

R574

A

1005-9202(2017)20-4992-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.016

〔2017-03-22修回〕

(編輯 滕欣航)