706例食管癌術后并發癥誘因及早晚期食管癌關鍵基因差異性表達研究

朱溢智, 徐 葉, 王雪艷, 劉凌翔

(1. 南京醫科大學, 江蘇 南京, 210000;2. 南京醫科大學第一附屬醫院 腫瘤科, 江蘇 南京, 210029)

706例食管癌術后并發癥誘因及早晚期食管癌關鍵基因差異性表達研究

朱溢智1, 徐 葉1, 王雪艷1, 劉凌翔2

(1. 南京醫科大學, 江蘇 南京, 210000;2. 南京醫科大學第一附屬醫院 腫瘤科, 江蘇 南京, 210029)

目的探討食管癌術后并發癥誘因，并對關鍵基因的mRNA、甲基化以及突變對不同食管癌分期的表達差異性進行分析。方法將2010—2013年以及2015—2016年南京醫科大學第一附屬醫院暨江蘇省人民醫院食管癌術后共706例連續患者進行回顧性分析。從癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫中共得到食管癌患者基因數據后進行統計分析。結果患者年齡與術后敗血癥發生相關(P=0.011), 術后pTNM分期與吻合口瘺(P=0.010)以及乳糜漏(P=0.030)的發生相關，患者的術后營養方式與吻合口瘺(P=0.041)的發生也顯著相關。對不同分期的食管癌患者, EPHA3 mRNA表達存在顯著差異(P=0.006); NOTCH1 DNA甲基化水平存在顯著差異(P=0.027); 具有統計學意義差異的突變基因是ZNF750 (P=0.037)、MALAT1 (P=0.044)。結論食管癌患者術后并發癥的發生與患者年齡、腫瘤TNM分期以及術后營養方式相關。EPHA3的mRNA表達、NOTCH1的甲基化在食管癌不同TNM分期下存在明顯差異，并且二者在中晚期患者中表達水平更高, ZNF750和MALAT1的缺失或插入性突變與食管癌的分期均呈負相關。

食管癌; 并發癥; 誘因; 腫瘤分期; mRNA; 甲基化; 突變基因; 差異

根據2017年最新統計數據，食管癌死亡率在美國男性當中排第7位且其5年生存率僅為12%～20%[1]。在中國，鱗形細胞癌是食管癌中最常見的組織學分型[2-3]。手術切除對于早期食管癌患者來說仍是最佳選擇[4]。有文獻[5-8]報道，食管癌術后存在3大嚴重的并發癥，分別為吻合口瘺、肺部感染和喉返神經損傷。Bertals等[9]研究結果顯示，對食管癌患者進行術前評估對預測手術相關死亡率有一定價值。目前，食管癌患者的平均5年生存率只有25%左右，而術后的2年生存率有34%[10-11]。本研究對中晚期與非中晚期食管癌患者可能存在的分子生物學差異進行研究，探討其中與食管癌發展相關的分子差異，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析南京醫科大學第一附屬醫院暨江蘇省人民醫院胸心外科2010—2013年以及2015—2016年入院行食管癌根治術的患者共706例。入組標準為: ① 所有患者均為術后患者; ② 術后病理診斷為食管癌; ③ 患者手術時間2010—2013年及2015—2016年; ④ 具有齊全的相關臨床信息，取得患者同意。于TCGA數據庫獲得164例食管癌病例，經過篩選并去除信息不全的病例后得到107例食管癌患者的117個關鍵基因mRNA表達數據、122個基因甲基化數據以及突變基因數據。

1.2 研究方法

對納入研究的食管癌術后患者的相關數據整理后進行回顧性分析; 統計手術時的患者年齡、性別，并根據AJCC 2012版分期標準進行術后病理TNM分期，按照2000年WHO食管癌組織學分類標準分為鱗形細胞癌、腺癌、小細胞癌共3類。記錄患者術后重癥監護室(ICU)治療時間、術后在院總時間，記錄患者術后營養方式，其中包括為單純腸內營養和腸內加腸外混合營養，根據手術入路將術式歸納為微創(腔鏡)、左后外切口(經左胸、經膈入腹)、右后外開胸開腹類以及經食管裂孔途徑(腹正中切口，擴大食管裂孔后入胸)共4類，統計下呼吸道感染、肺不張、胸腔(心包)積液、心律失常、肺栓塞、敗血癥、吻合口瘺、乳糜漏、幽門梗阻共9項術后并發癥發生情況。另外，將TCGA數據庫獲得的107例食管癌患者的數據進行整理，根據患者病理TNM分期以Ⅰ、Ⅱ期為A組，Ⅲ、Ⅳ期為B組，再將得到的數據進行PSM匹配，排除了年齡、性別、種族、組織學分類以及煙酒暴露等因素的混雜影響，從而獲得用于后續差異性分析的數據。將A、B組基因mRNA、甲基化表達值進行獨立樣本t檢驗，從而得到具有差異的關鍵基因。另外，通過Spearman相關性分析得到A、B組間存在顯著差異的突變基因。

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件及RStudio1.0.136進行統計分析，基因表達的相關臨床數據經過RStudio進行PSM匹配后再由SPSS軟件行獨立樣本t檢驗和Spearman相關性分析，術后并發癥誘因分析采用多變量分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 入組706例食管癌術后患者的臨床特征

入組的706例患者中，男524例(占74.2%), 女182例(占25.8%); 手術時患者年齡為32～86歲，中位手術年齡為62歲; 腺癌共32例(占5%), 鱗癌共659例(占93%), 神經內分泌癌共15例(占2%), 腫瘤TNM分期從0至Ⅳ期分別有39例(占6%)、151例(占21%)、241例(占34%)、270例(占38%)、5例(占1%)。

2.2 食管癌術后并發癥誘因分析結果

在706例患者中，對于納入的9種并發癥，包括下呼吸道感染、肺不張、胸腔(心包)積液、心律失常、肺栓塞、敗血癥、吻合口瘺、乳糜漏、幽門梗阻，發生的患者總例數(發病率)分別289例(40.9%)、24例(3.4%)、464例(65.7%)、129例(18.3%)、0例(0%)、2例(0.3%)、12例(1.7%)、4例(0.6%)、1例(0.1%)。

對數據進行多變量分析后發現，患者年齡與術后發生敗血癥顯著相關(P=0.011), 發生敗血癥的患者年齡在70歲以上; 患者的術后pTNM分期與術后發生吻合口瘺、乳糜漏顯著相關(P=0.010、0.030), 分期較高的患者術后更易發生吻合口瘺、乳糜漏; 另外，術后給予患者的營養支持方式與吻合口瘺的發生也具有相關性，術后以單一腸內營養的患者術后吻合口瘺發生率為2.53%, 顯著高于術后給予腸內加腸外混合營養的患者0.64%的吻合口瘺發生率(P=0.041)。見表1。

表1 術后并發癥誘因分析結果

2.3 A、B組食管癌患者關鍵基因mRNA及甲基化表達差異和突變分析

從TCGA數據庫獲得并篩選得到具有全面相關信息的107例食管癌患者的117個關鍵基因mRNA表達數據、122個關鍵基因甲基化數據，見表2。

表2 107例食管癌患者臨床特征[n(%)]

經過PSM匹配后，排除其他對分期的混雜因素的影響后，得到了117個mRNA表達數據、患者的122個甲基化數據以及不同突變基因數據。分析A、B組的數據，對mRNA及甲基化表達進行獨立樣本t檢驗，而對突變基因數據進行Spearman相關性分析，最終得到在A、B組之間EPHA3的mRNA表達存在顯著差異(P=0.006), NOTCH1的甲基化水平存在顯著差異(P=0.027), 見表3。

另外，具有統計學意義的缺失或插入性突變基因有ZNF750(相關性為-0.211,P=0.037)和MALAT1(相關性為-0.204,P=0.044), 并且這2個基因在A組的突變率分別為8.16%、12.24%, 均高于B組的突變率0%、2.04%。

3 討 論

手術是食管癌十分重要的治療手段。有研究[12]表明，有多種因素可以造成吻合口的愈合不良，如營養不良、術前合并呼吸系統疾病、吻合口血供不足、張力過高、感染、吻合口位置、吻合技術等。本文對術后吻合口瘺的發生與可能相關的影響因素分析發現，患者的術后營養支持方式(單一腸內營養對比腸內加腸外混合營養)以及術后pTNM分期與術后吻合口瘺的發生有顯著相關性。食管作為消化系統器官，食管癌患者伴隨體質量下降和營養風險的比率在60%～70%以上，惡液質發生率在60%～80%, 僅次于胃癌，因此食管癌患者很容易伴隨營養不良[13]。除了患者術后營養方式的影響之外，患者的pTNM分期越高，其腫瘤負荷以及腫瘤對機體的營養消耗越大，此類患者較分期較早的患者更容易發生營養不良，從而影響后續術后吻合口的愈合。另外，乳糜漏是食管癌術后較嚴重的術后并發癥之一，嚴重者可能會導致血容量減少、代謝及營養狀況的異常甚至死亡[14-16]。已有研究[17]證實，具有更多陽性淋巴結轉移的食管癌術后患者更易發生乳糜漏(P=0.041)。因此，這也解釋了患者的術后pTNM分期與術后乳糜漏的發生有著密切關系。此外，患者接受手術時的年齡與術后發生敗血癥的發生關系密切，小于70歲的患者群體的敗血癥發生率為0%, 而≥70歲的患者群體的敗血癥發生率為1.9%。可以推論，隨著患者年齡的增加，手術恢復的時間和難度都增加，患者機體抵抗感染的能力下降，使得術后發生敗血癥的概率也隨之增加[18]。對于接受手術時年齡較大的患者，術后應該積極預防感染以及防止因為長期臥床而導致的褥瘡的發生，從而降低高齡患者術后敗血癥的發生率。

表3 A、B組EPHA3 mRNA表達水平和NOTCH1甲基化水平獨立樣本T檢驗結果

EPHA3編碼了EPH受體A3, 并且屬于蛋白-酪氨酸激酶家族的ephrin受體亞家族，參與了多種腫瘤相關的信號通路，并且已經有研究[19-20]證實, Ephs和ephrins在食管癌中過表達，并與預后差相關。本研究顯示，中晚期患者和非中晚期患者EPHA3 mRNA的表達存在顯著差異，且在中晚期患者中更多表達(P=0.006), 意味著EPHA3在食管癌的發展中發揮著一定作用，可能預示著較差的預后。另外，在中晚期與非中晚期患者之間具有顯著差異的還有NOTCH1甲基化水平，并且相似得在中晚期患者中其甲基化水平更高(P=0.027)。相比于食管腺癌, NOTCH1突變在食管鱗癌中更加多見，并可能參與調節鱗狀細胞分化[21]。有研究[22]表明, NOTCH1的過表達是食管鱗癌患者的顯著獨立預后因素, NOTCH1過表達的食管癌患者預后較差。此外，與食管癌分期呈負相關的包括ZNF750(P=0.037)和MALAT1 (P=0.044)突變。MALAT1在多種腫瘤中高表達，包括乳腺癌、結腸癌、肝癌、膀胱癌、宮頸癌等[23-27]。還有研究[28]表明在食管鱗癌中MALAT1的過表達與腫瘤的分期、原發灶大小以及淋巴結轉移呈正相關。研究[29]發現，當MALAT1的3′端6 918 nt至8 441 nt片段發生突變時, MALAT1會喪失促進細胞增殖與侵襲轉移的能力。ZNF750是p63的一個靶基因，可誘導終末表皮分化[30]。有研究[21, 31]發現, ZNF750的表達與突變率都在食管鱗癌患者中有著顯著增高，并且認為ZNF750可能以類似NOTCH1通過調節鱗狀細胞分化的方式從而成為食管鱗癌新的腫瘤抑制因子。

綜上所述，食管癌術后并發癥可以與患者年齡、腫瘤TNM分期以及術后營養方式相關。EPHA3的mRNA表達水平以及NOTCH1的甲基化水平在食管癌不同TNM分期下存在顯著差異，并且二者在中晚期患者中表達水平更高。另外, ZNF750和MALAT1的缺失或插入性突變與食管癌的分期均呈負相關。

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Analysisofpredisposingfactorsofpostoperativecomplicationsof706patientsandthedifferentialexpressionofkeygenesinearlyandadvancedstagesofesophagealcancer

ZHUYizhi1,XUYe1,WANGXueyan1,LIULingxiang2

(1.NanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu, 210000; 2.DepartmentofOncology,TheFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu, 210029)

ObjectiveTo study the predisposing factors of postoperative complications of esophageal cancer, and analyze the different genetic expression of mRNA, DNA methylation and mutations with different esophageal cancer staging.MethodsA total of 706 patients with esophageal cancer from the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University and Jiangsu People′s Hospital from 2010 to 2013 and 2015 to 2016 were involved in this study. Data of genetic information from 107 patients with esophageal cancer were obtained from the Cancer Genome Atlas (TCGA) database.ResultsThe analysis showed that age was correlated with SEP (P=0.011), and pTNM staging was correlated with the occurrence of AF (P=0.010) and CL (P=0.030). The postoperative nutritional pattern was also significantly associated with the occurrence of AF (P=0.041). There was a significant difference in the expression of EPHA3 mRNA in patients with esophageal cancer in different TNM stage (P=0.006), DNA methylation level of NOTCH1 (P=0.027), and mutations genes such as ZNF750 (P=0.037) and MALAT1 (P=0.044).ConclusionPostoperative complications of esophageal cancer could be associated with patients′age, TNM staging and postoperative nutritional patterns. The expression of EPHA3 mRNA and the DNA methylation of NOTCH1 show significant difference in different TNM stages of esophageal cancer, and both of them have higher expression in advanced patients. Mutation of ZNF750 and MALAT1 are negatively correlated with the staging of esophageal carcinoma.

esophageal cancer; postoperative complications; predisposing factors; tumor staging; mRNA; DNA methylation; gene mutation; difference

R 735.1

A

1672-2353(2017)19-091-04

10.7619/jcmp.201719026

2017-04-16

國家自然科學基金面上項目(81472782); 江蘇省自然科學基金面上項目(BK20141491)

劉凌翔