siRNA沉默表皮生長因子受體蛋白表達對腎癌細胞生物學行為的影響

汪 峰, 張斌斌, 郭 巍, 高繼學, 強亞勇, 賈軍琪

(延安大學附屬醫院, 陜西 延安, 716000)

siRNA沉默表皮生長因子受體蛋白表達對腎癌細胞生物學行為的影響

汪 峰, 張斌斌, 郭 巍, 高繼學, 強亞勇, 賈軍琪

(延安大學附屬醫院, 陜西 延安, 716000)

目的觀察在siRNA沉默EGFR基因處理后腎癌細胞的生物學行為情況。方法將腎癌細胞株ACHN分為3組，對照組不進行任何干預，陰性對照轉染組使用加入非特異性轉染試劑及siRNA干預，觀察組使用加入特性性轉染試劑及siRNA干預，分別檢測3組細胞的EGFR表達量、增殖活性、生長曲線、遷移及侵襲活性。結果經siRNA處理72 h后，觀察組細胞EGFR表達水平明顯低于陰性對照轉染組和對照組; 觀察組細胞生長活躍能力顯著低于對照組和陰性對照轉染組，且在處理48 h后RNAi組細胞數顯著低于對照組和陰性對照轉染組(P<0.05); 較空白組和陰性對照轉染組，觀察組細胞生長受到顯著抑制(P<0.05); 12 h時及24 h時觀察組細胞劃痕距離顯著高于對照組和陰性對照轉染組(P<0.05); 12 h時對照組、陰性對照轉染組穿膜細胞數差異無統計學意義(P>0.05), 觀察組穿膜細胞數顯著低于對照組和陰性對照轉染組(P<0.05)。結論 采用siRNA沉默EGFR蛋白后，可有效改善腎癌細胞的增殖、生長、遷移及侵襲等生物學活性。

siRNA; EGFR蛋白; 腎癌細胞; 生物學行為

有研究[1-2]結果表明，在腎癌細胞中表皮生長因子受體(EGFR)多過度表達，且其與腫瘤細胞的凋亡、增殖、血管生成、轉移等諸多過程密切相關，可作為腎癌患者的重要的治療靶點。RNA干擾(RNAi)可有效控制基因表達，也在腫瘤治療的基礎研究中廣泛應用[3]。作者采用RNA干擾技術沉默EGFR基因表達，觀察在RNA沉默EGFR基因處理后腎癌細胞的生物學行為，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究中人腎細胞癌細胞株(ACHN)購自國家典型培養保藏中心(武漢)。RPMI 1640培養基、胰蛋白酶購自Gibco公司(美國)，胎牛血清購自BI公司(以色列), β-actin抗體、兔抗二抗、二氨基聯苯胺(DAB)、噻唑藍(MTT)購買自Sigma公司(美國), EGFR抗體購買自CST公司(美國)，轉染試劑盒購買自Life公司(美國), RIPA裂解液購買自碧云天公司(上海), Transwell小室購買自Millipore公司(美國), Matrigel膠購買自BD公司(美國)。

1.2 SiRNA的設計及合成

使用OptiRNAi設計可特異性沉默EGFR的SiRNA序列，并由上海吉瑪制藥公司合成，其序列表為正義鏈5′-gaaggugagaaaguuaaaauucctt-3′, 陰性對照組5′-uucuccgaacgugucacgutt-3′。

1.3 細胞培養與處理

使用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養基培養ACHN細胞，將細胞置于37 ℃, 含5%CO2的培養箱中培養。本研究將細胞分為3組，即空白對照組、陰性對照轉染組(加入非特異性轉染試劑及siRNA)、觀察組(加入特異性轉染試劑及siRNA)。取對數生長期細胞，使用胰酶消化后將細胞接種于35 mm細胞培養皿中。待細胞密度生長致70%左右時，參照轉染試劑盒說明書進行siRNA轉染，后繼續培養4 h后換液，并收集細胞。

1.4 EGFR Western Blot檢測結果

使用RNA干擾72 h后，使用磷酸鹽緩沖溶液漂洗細胞2遍，后收集細胞使用RIPA裂解液處理細胞，置于冰上振搖30 min, 后使用Thermo離心機以12 000 r/min離心10 min, 收集上清，使用二喹啉甲酸測定總蛋白后，調整蛋白濃度至等體積，后加入等體積的上樣緩沖液(2×)沸水浴5 min。后使用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，采用280 mA恒流轉膜1 h, 將蛋白轉移至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉封閉2 h, 使用TBST清洗3次，加入EGFR抗體, 4 ℃孵育過夜，使用TBST清洗3次，加入二抗室溫孵育1 h, 使用TBST細胞曝光顯色。

1.5 生長曲線檢測方法

依照分組對細胞進行處理并接種于24孔板中，每組3復孔。放入37 ℃, 含5%CO2的培養箱中培養，每24 h取3復孔，進行計數并繪制細胞生長曲線。

1.6 細胞增殖檢測方法

將細胞依照分組處理，調整細胞濃度至5×107/L接種于96孔板中，每孔200 mL, 每組6個復孔。使用無血清培養基培養24 h、48 h、72 h及96 h，每孔加入10 μL MTT溶液(5 μg/L), 急性培養4 h, 后加入10 μL二甲基亞砜震蕩10 min, 后再572 nm波長下檢測各孔吸光度值(A), 并計算細胞增殖抑制率(IR)。

IR(%)=[A對照組-A實驗組]/A對照組×100%。

1.7 遷移能力檢測

將細胞依照分組處理并接種于24孔板中，培養24后使用10 μL槍頭在細胞皿中劃1道橫線，每12 h觀察并拍照1次，后使用NIS-ELEMENTS軟件分析各組細胞遷移差異。

1.8 Transwell實驗檢測

由金斯瑞公司構建H2 BmCherry穩轉細胞系，使用無血清1640培養基培養細胞10 h, 并使用無血清1640培養基稀釋Matrigel膠(1∶8), 每小室鋪膠60 μL, 后將細胞以5×104/μL的濃度置于小室中，上室加入無血清培養基，下室加入1 mL含血清1640培養基培養12 h, 后取出Transwell小室并使用棉棒擦凈上室細胞，使用顯微鏡去5個視野，計算視野中穿膜的細胞數。

1.9 統計學方法

本研究中使用SPSS 19.0存儲并處理原始數據，使用均值±標準差表示計量資料，并行方差分析組間差異,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Western Blot檢測結果

本研究結果顯示，經siRNA處理72 h后，觀察組細胞EGFR表達水平明顯低于陰性對照轉染組和對照組，見圖1。

1：對照組；2：陰性對照轉染組；3：觀察組圖1 RNAi72h后不同組EGFR表達水平

2.2 生長曲線

本研究結果顯示，觀察組細胞生長活躍能力顯著低于對照組和陰性對照轉染組，且在處理48 h后RNAi組細胞數明顯低于對照組和陰性對照轉染組(P<0.05)，見圖2。

圖2 生長曲線

2.3 MTT檢測結果

較空白組和陰性對照轉染組，觀察組細胞生長受到顯著抑制(P<0.01), 且隨著作用時間增長，抑制作用也逐漸增加，見表1。

表1 細胞生長抑制率 %

與觀察組相比, **P<0.01。

2.4 細胞遷移能力檢測結果

12、24 h時，觀察組細胞劃痕距離顯著高于對照組和陰性對照轉染組(P<0.05), 但對照組與陰性對照轉染組間差異無統計學意義(P>0.05), 見表2。

表2 細胞遷移能力檢測結果 μm

與觀察組相比, *P<0.05, **P<0.01。

2.5 細胞侵襲能力檢測結果

本研究結果顯示, 12 h時對照組、陰性對照轉染組穿膜細胞數分別為(322.5±20.0)個和(300.0±16.5)個，差異無統計學意義(P>0.05), 觀察組穿膜細胞數為(154.5±13.0)個，顯著低于對照組和陰性對照轉染組(P<0.05)。

3 討 論

有大量研究[4-5]指出，在多種腫瘤組織中EGFR常處于高表達狀態，如腎癌、直腸癌、肺癌、卵巢癌等，其中在腎癌中50%以上為EGFR高表達。有學者研究[6]指出，腎癌細胞膜中EGFR是重要生物標志物，其異常高表達可作為患者預后不良的重要評價指標。此外，EGFR的高表達也使其可作為重要的指標靶點，進行靶向治療[7]。RNA干擾具有高效性、特異性、穩定性等諸多優點，且目前RNA干擾技術在卵巢癌、肺癌等諸多腫瘤中的應用十分廣泛[8]。采用siRNA技術干預腫瘤細胞后，可有效敲減細胞EGFR表達水平改善化療藥物的不敏感效應。

免疫治療是現階段臨床中的研究熱點，但腎癌患者采用免疫療法進行治療時其臨床有效率偏低，因而其仍無法成為臨床中治療腎癌的有效手段[9]。此外，采用傳統的放療及化療手段進行治療，仍存在明顯的敏感性低等現象[10]。有研究[11-12]指出，若腎癌患者不進行及時干預，則有可能向腦部及肺部轉移，進而導致患者完全喪失最佳的治療時機。目前靶向治療仍是治療晚期腎癌的首選方案，因而尋求有效的靶點也是現階段臨床研究的熱點所在。有研究[13]指出，采用siRNA可有效沉默腎癌細胞VEGF的表達，并可顯著降低腎癌細胞的遷移及侵襲能力。

EGFR通路與轉化生長因子(TGF)、血管生長因子(VEGF)等通路密切相關的細胞轉導通路。在腫瘤細胞中EGFR常異常高表達，使EGFR持續活化，進而增強下游信號轉導能力，打破正常細胞的地生理平衡，增強細胞的侵襲和轉移能力[14-16]。此外，其還可以增強VEGF、血管形成素-1(Ang-1)等血管生成相關因子的表達水平，增強腫瘤組織的血管新生能力[17-18]。

本研究結果顯示，采用siRNA沉默EGFR蛋白后，可有效降低ACHN細胞的EGFR蛋白水平。MMT和生長曲線結果顯示，特異性沉默EGFR蛋白后，可有效降低ACHN的細胞活力。通過遷移和侵襲實驗證明, siRNA沉默EGFR蛋白后可有效降低腎癌細胞的遷移和侵襲能力。分析[19-20]認為，采用siRNA特異性沉默ACHN細胞的EGFR蛋白后，可有效抑制EGFR相關信號轉導通路的激活，降低腫瘤細胞的VEGF、TGF、Ang-1的表達水平，進而顯著改善ACHN細胞的生物學行為。

綜上所述，本研究通過劃痕、侵襲等實驗發現，采用siRNA沉默EGFR蛋白后，可有效改善腎癌細胞的增殖、生長、遷移及侵襲等生物學活性。

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EffectofsiRNAsilencingepidermalgrowthfactorreceptorproteinexpressiononbiologicalbehaviorofrenalcellcarcinomacells

WANGFeng,ZHANGBinbin,GUOWei,GAOJixue,QIANGYayong,JIAJunqi

(AffiliatedHospitalofYan′anUniversity,Yan′an,Shaanxi, 716000)

ObjectiveTo explore the biological behavior of renal cell carcinoma cases after treatment with siRNA silencing epidermal growth factor receptor (EGFR) gene.MethodsRenal cell carcinoma cell line ACHN were divided into three groups, the control group without any intervention, negative control transfection group by adding the nonspecific transfection reagent and siRNA interference, and the observation group adding transfection reagent and siRNA interference. Cells with EGFR expression and proliferation activity, growth curve, migration and invasion activity were detected in three groups.ResultsAfter 72 h of siRNA treatment, the observation group had significantly lower EGFR expression levels, and cell growth activity ability, and cell number of RNAi group after 48 h than negative control transfection group and control group (P<0.05). Compared with the blank control group and negative control transfection group, the observation group was significantly inhibited (P<0.05), and cell scratch distance after 12 h and 24 h was significantly higher than that of the control group and negative control transfection group(P<0.05). The control group and negative control transfection group showed no significant difference in the cell membrane at 12 h (P>0.05). The observation group had significantly lower transmembrane cell number than the control group and negative control transfection group(P<0.05).ConclusionThe proliferation, growth, migration and invasion of renal carcinoma cells can be effectively improved by using siRNA EGFR protein.

siRNA; EGFR protein; renal cell carcinoma; biological behavior

R 736.6

A

1672-2353(2017)19-103-04

10.7619/jcmp.201719029

2017-05-19

賈軍琪