骨形成蛋白2在腦多形性膠質母細胞瘤中的表達及臨床意義

張少校，吳瑛

（1. 遼寧省盤錦市中心醫院VIP病房，遼寧 盤錦 124010； 2. 中國醫科大學附屬第一醫院全科醫學科，沈陽 110001）

骨形成蛋白2在腦多形性膠質母細胞瘤中的表達及臨床意義

張少校1，吳瑛2

（1. 遼寧省盤錦市中心醫院VIP病房，遼寧 盤錦 124010； 2. 中國醫科大學附屬第一醫院全科醫學科，沈陽 110001）

目的分析人多形性膠質母細胞瘤（GBM）中骨形成蛋白2 （BMP2）表達的預后意義和可能的相關信號機制。方法利用癌癥基因組圖譜（TCGA） 數據庫獲取GBM標本的RNASeqV2數據，從人類腫瘤相關基因表達匯編（GEO） 數據庫下載GBM樣本數據集GSE7696的表達譜數據。利用單因素Kaplan-Meier和多因素COX逐步回歸法確定BMP2表達與GBM患者預后的關系。利用基因集富集分析方法預測BMP2相關的基因通路。結果低表達BMP2是GBM術后患者預后不良的獨立因素。BMP2 低表達富集了干擾素α反應的相關通路。結論GBM組織中BMP2低表達預示患者預后不良，其作用機制可能是干擾素α反應基因異常。

骨形成蛋白2； 多形性膠質母細胞瘤； 癌癥基因組圖譜； 基因表達匯編

網絡出版時間：

多形性膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是惡性程度最高的顱內惡性腫瘤，呈高度浸潤性且血供豐富，還具有獨特的免疫體系和較強的逃避免疫監視功能［1］，深入研究GBM發生發展的基因分子機制，對于改善GBM的診治以及患者的預后有重要的臨床意義。

骨形成蛋白家族（bone morphogenetic proteins，BMPs）屬于轉化生長因子β超家族，BMPs在多種惡性腫瘤中表達并影響其發生、發展［2］。BMP2為活性較強的BMPs成員之一，與GBM關系密切，但作用機制不明［3］。本研究利用在線高通量數據，采用生物信息學分析方法探討BMP2在GBM組織中的表達及意義。

1 材料與方法

1.1 資料收集

本研究利用癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA） 數據庫（https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）下載并預處理GBM的RNASeqV2 數據（ level 3）。TCGA 數據集共納入有完整生存資料和mRNA表達譜的GBM患者152例（男98例、女54例，中位年齡60.5歲） 。利用美國國家生物信息技術中心（national center for biotechnology information，NCBI）的人類腫瘤相關基因表達匯編（gene expression omnibus，GEO） 數據庫（http：：//www.ncb.nlm.nih.gov/geo）下載GBM樣本數據集GSE7696的表達譜數據，僅保留原發GBM且臨床資料和生存信息完整的病例。GSE7696數據集共納入GBM術后患者70例 （男51例、女19 例，中位年齡52.2歲）。

1.2 TCGA數據集BMP2 表達與患者預后的關系

提取BMP2的表達數據。評估的終點指標為患者的總生存。采用R的Maxstat函數包（常用統計學軟件，可用于線性、非線性回歸、多因素、相關及時間序列分析［4］）確定區分BMP2表達水平分級的最佳界值［5］。根據該值，兩分BMP2的表達數據為“高表達”和“低表達”2組。R/survival函數包用于生存分析。Kaplan-Meier法用于繪制生存曲線，多因素COX逐步回歸法用于確定預后相關的獨立因素。P ＜ 0.05 為差異有統計學意義。

1.3 生存分析結果的外部驗證

GSE7696數據集［6］以探針信號強度反映基因的相對表達量，若同一基因的多個探針信號強度不同，則取其中位數。由低到高對BMP2表達水平進行排序，＜33%為低表達，33%～67%為中表達，＞67%為高表達。利用多因素COX逐步回歸法，以患者年齡、性別以及術后治療方案等指標作為調整因素，研究BMP2表達是否是GBM術后患者的獨立預后因素。P ＜ 0.05 為差異有統計學意義。

1.4 BMP2基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）

GSEA將芯片表達數據進行排序，然后與預先構建好的功能基因集進行比較，尋找這些基因在選定功能基因集中出現與否以及排序位置，分析是否具有共同的表達趨勢，以此來解讀數據中蘊含的生物學信息［7］。本研究采用GSEA2.2.2 版軟件，根據TCGA 數據集BMP2 表達的中位值（ 原始讀長為2.97） 將患者分為低表達和高表達2組，選用GSEA網站MsigDB 數據庫中的h.all.v5.2.symbols.gmt 數據集作為參照基因集，分析不同BMP2 表達對參照基因集各個通路的影響。進行GSEA時，采用缺省加權富集統計以及1 000次的隨機組合次數，有統計學意義的富集基因集的確立標準是P ＜ 0.05以及錯誤發現率（false discovery rate，FDR） ＜ 0.25 。

2 結果

2.1 利用TCGA數據集分析不同BMP2 表達與GBM患者生存的關系

根據R的Maxstat函數包確定BMP2表達水平分級的最佳界值為6.4（圖1），據此將GBM患者分為2個亞組，BMP2高表達組為21例，低表達組為131例。進一步進行生存分析，結果顯示，在TCGA 數據集中BMP2 低、高表達者的中位生存時間分別為34.0和42.5個月，二者比較有統計學差異（P = 0.018），見圖2 。

2.2 利用GSE7696 數據集進行外部驗證

在GSE7696數據集的70例患者中，BMP2低、中、高表達者分別為23、24和23例。以年齡、性別、術后輔助治療方案為調整因素，以BMP2表達水平為自變量，進行多因素COX分析。結果顯示，BMP2是GBM術后患者的獨立預后因素，低表達BMP2提示患者預后不佳（HR = 1.441，P = 0.029），見表1。

圖1 利用R的maxstat函數包確定BMP2表達分級的最佳界值Fig.1 Cutoff for the significance of BMP2 expression calculated using the R maxstat package

2.3 BMP2 的功能基因集GSEA情況

根據本研究中富集基因集的確立標準，BMP2低表達樣本所富集的是干擾素α（interferon α，IFN-α）反應上調的82個標志性基因（P ＜ 0.01，FDR =0.000 4）。見圖3。

圖2 利用Kaplan-Meier法確定BMP2表達與患者預后的關系Fig.2 Kaplan-Meier analysis showing the correlation between BMP2 expression and survival

3 討論

在目前發現的超過40種BMP中，BMP2為活性最高的多能細胞因子，可影響細胞的遷移、分化、增殖、凋亡以及基因的轉錄表達，參與調控中胚層形成、神經系統發生等多種生理過程［8］，加速骨關節炎、骨質疏松癥等多種疾病的進程［2-8］。BMP2 表達異常還影響肺癌、乳腺癌和結腸癌等多種惡性腫瘤的發生、發展或轉歸［9］，腫瘤細胞增殖、凋亡與侵襲、轉移以及腫瘤血管新生相關途徑被確認為主要相關作用機制［10］。與正常腦組織相比較，BMP2在膠質瘤中表達量增高，且與惡性程度分級呈正相關［11］。進一步研究［12］證實，BMP通過拮抗多種與維持GBM干細胞特征相關的因子而影響GBM的發生與發展。缺氧是促進GBM的重要因素，而BMP2通過下調缺氧誘導因子1α的穩定性影響原代GBM細胞的穩定性［13］，并增強GBM干細胞樣細胞對替莫唑胺的敏感性，促進細胞凋亡［12］。但是，目前BMP2與GBM患者生存的關系及相關機制尚不明確。

表1 BMP2表達與患者生存關系的單因素和多因素分析Tab.1 Univariate and multivariate Cox regression analysis of the relationship between BMP2 expression and survival

圖3 GSEA確定BMP2 低表達富集到IFN-α反應相關基因Fig.3 GSEA identified that IFN-αresponse-genes were enriched in samples with low BMP2 expression

本研究利用TCGA 和GEO 數據集，結合生物信息學分析，證實在GBM組織中，BMP2 高表達患者的生存期更長，2個數據集的結果一致。因此，BMP2表達可作為評價GBM患者預后的指標。

干擾素家族蛋白是由宿主細胞產生并釋放于機體內，應對多種病原，如病毒、細菌以及惡性腫瘤細胞等，調節機體免疫反應的重要治療性細胞因子［14］，包括Ⅰ型和 Ⅱ型兩大類。作為Ⅰ型干擾素和重要的抗腫瘤性細胞因子，IFN-α已被廣泛用于慢性髓細胞白血病和多發性骨髓瘤等多種血液病以及淋巴瘤和胃腸道腫瘤等實體腫瘤的治療［15］。然而，IFN-α內源性抵抗是導致多種惡性腫瘤免疫逃逸，影響患者預后和免疫治療療效的重要因素［15］。與多種惡性腫瘤相比，GBM對干擾素原發耐藥，但是機制不清。本研究GESA方法發現，BMP2低表達的樣本中富集了IFN-α作用后上調的基因，提示BMP2低表達可能與IFN-α的內源性抵抗以及耐藥有關。BMP2基因可能對抗GBM細胞中IFN-α內源性抵抗相關的標志性基因的上調，降低腫瘤細胞的IFN-α抵抗和免疫逃逸過程。

GBM呈現高度浸潤性，并有血腦屏障保護，進行傳統的手術、放療或化療的療效差。免疫治療可作為GBM的第4種治療模式。然而，GBM的免疫逃逸生物學特性又是影響惡性腫瘤廣泛浸潤、治療療效和患者預后的重要因素。因此，深入研究GBM的免疫逃逸機制，對增強免疫治療的療效、改善GBM患者的預后至關重要。下階段可以利用GBM臨床標本，聯合檢測BMP2基因和IFN-α反應性基因的表達，評估其預后價值并進一步探討相關分子機制。

綜上所述，本研究利用TCGA及GEO數據庫推測出GBM組織BMP2低表達提示GBM患者預后不佳，IFN-α反應相關基因的調節可能是BMP2在GBM中的作用機制。

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（編輯 于 溪）

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Analysis of the Clinical Significance of Bone Morphogenetic Protein 2 in Glioblastoma Multiforme

ZHANG Shaoxiao1，WU Ying2

（1. VIP Department，Liaoning Provincial Panjin City Centre Hospital，Panjin 124010，China； 2. General Practice Department，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the prognostic significance of bone morphogenetic protein 2 （BMP2） expression in glioblastoma multiforme （GBM） and related pathways.MethodsRNASeqV2 data and GSE7696 series matrix data were downloaded from The Cancer Genome Atlas （TCGA） and The Gene Expression Omnibus （GEO） database，respectively. The correlation between BMP2 expression and prognosis was evaluated using Kaplan-Meier and multivariate COX analysis. Gene set enrichment analysis （GSEA） was used to predict the functional gene sets and/or pathways modulated by BMP2.ResultsDecreased expression of BMP2 is an independent predictor of poor prognosis. Furthermore，genes that are upregulated in response to interferon-αproteins were enriched in samples with low BMP2 expression.ConclusionLow expression of BMP2 indicates poor prognosis in GBM patients. Genes that are upregulated in response to interferon-α proteins may also be implicated in prognosis.

bone morphogenetic protein 2； glioblastoma multiforme； the cancer genome atlas； gene expression omnibus

R739.4

A

0258-4646（2017）11-0976-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.11.004

國家自然科學基金（ 81302023，81201801）

張少校（1978-），男，副教授，碩士.

吳瑛，E-mail：1779716865@qq.com

2017-04-14