長鏈非編碼RNA HOTAIR對外陰鱗狀細胞癌A431細胞生物學行為的影響

趙曉宇，程蓉蓉，歐陽玲

（中國醫科大學附屬盛京醫院婦產科，沈陽 110004）

長鏈非編碼RNA HOTAIR對外陰鱗狀細胞癌A431細胞生物學行為的影響

趙曉宇，程蓉蓉，歐陽玲

（中國醫科大學附屬盛京醫院婦產科，沈陽 110004）

目的探討長鏈非編碼RNA （lncRNA） HOTAIR對外陰鱗狀細胞癌A431細胞生物學行為的影響。方法采用實時熒光定量PCR檢測外陰鱗狀細胞癌A431細胞與正常表皮HaCaT細胞中HOTAIR的表達水平，轉染HOTAIR siRNA至A431細胞后采用CCK-8法檢測各組細胞活性，流式細胞術檢測細胞凋亡，Transwell小室遷移實驗檢測細胞遷移情況，Transwell小室侵襲實驗檢測細胞侵襲情況。結果HOTAIR在A431細胞中的表達高于正常表皮HaCaT細胞；下調A431細胞中HOTAIR表達后，細胞增殖、遷移及侵襲能力均降低（P均＜0.05），而凋亡率增加（P ＜ 0.05）。結論lncRNA HOTAIR可能在調控外陰鱗狀細胞癌細胞的增殖、凋亡、遷移及侵襲行為中起重要作用。

外陰鱗狀細胞癌； HOTAIR； siRNA； 生物學行為

外陰鱗狀細胞癌（簡稱外陰鱗癌）是外陰癌最常見的病理類型，約占90%，晚期患者5年生存率不超過20%［1］。目前其治療強調個體化，更重視手術聯合放化療、靶向治療等綜合治療以改善患者生活質量［2-3］。因此，探索治療外陰鱗癌的靶點有重要意義。近年來研究發現長鏈非編碼RNA （long non-coding RNAs，lncRNA） HOX基因轉錄反義基因間RNA （HOX transcript antisense intergenic RNA， HOTAIR）在多種疾病（腫瘤、心血管疾病和神經系統疾病等）中存在差異表達，尤其是與腫瘤性疾病相關。本課題組前期研究［4］提示lncRNA HOTAIR在外陰鱗癌組織中表達失調，但HOTAIR是否對外陰鱗癌細胞的生物學行為起作用尚不清楚。本研究旨在探討lncRNA HOTAIR對外陰鱗癌細胞生物學行為的影響，為外陰鱗癌的治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系來源：外陰鱗癌A431細胞購自上海富衡生物有限公司；正常表皮HaCaT細胞購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司。

1.1.2 主要儀器及試劑：DMEM/高糖培養液購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自以色列Bioind公司，HOTAIR siRNA序列及陰性對照（negative control，NC）siRNA序列購自蘇州吉瑪生物有限公司，脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，總RNA提取試劑RNAiso plus、反轉錄試劑盒（Primescript RT reagent kit）及實時PCR試劑盒（SYBR Premix Ex Taq）均購自日本TaKaRa公司，PCR引物購自上海生工生物工程有限公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國ADL公司，Transwell小室購自美國Costar公司，Matrigel基質膠購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：外陰鱗癌A431細胞及正常表皮HaCaT細胞用適量含10%胎牛血清、1%青—鏈霉素的DMEM/高糖培養液，37 ℃、5% CO2條件下培養。選取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 檢測2種細胞中HOTAIR的表達：按照說明書TRIzol法提取2種細胞的總RNA，按反轉錄試劑盒說明書1 μ g總RNA在10 μ L體系中用gDNA Eraser去除基因組DNA，在20 μ L反應體系中反轉錄成cDNA。根據實時PCR試劑盒說明書取適量cDNA產物在20 μ L反應體系中用Roche480機器進行擴增并獲得HOTAIR的Ct值，以GAPDH的Ct值作內參，應用2-ΔΔCt法進行計算。

1.2.3 細胞轉染及轉染效率檢測：對數生長期的A431細胞以4×105/孔接種于6孔板，待70%～80%融合時更換無血清培養基，按轉染試劑說明書進行HOTAIR siRNA序列轉染，分為空白對照組（A431組）、轉染陰性對照組（A431-NC組）及轉染HOTAIR siRNA實驗組（A431-siHOTAIR組），轉染6 h后更換成完全培養液繼續培養。轉染48 h時提取各組細胞的RNA檢測HOTAIR的表達，實驗重復3次。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖情況：對數生長期的A431細胞以1×104/孔接種于96孔板，按前述方法轉染各組細胞后，按CCK-8試劑盒說明書分別在轉染0、24、48和72 h檢測各組細胞活性。以時間為橫軸，吸光度值（A值）為縱軸繪制細胞生長曲線，實驗重復3次。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡情況：收集轉染48 h后的A431細胞，按Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書操作1 h內流式細胞儀測定、CellQuest Pro軟件分析細胞凋亡，實驗重復4次。

1.2.6 Transwell遷移實驗檢測細胞遷移能力：取轉染24 h后的3組A431細胞制成單細胞懸液，調整密度為 5×105/mL。將3個Transwell小室放入24孔板中，每個小室加入對應細胞懸液100 μ L（即5×104/孔），小室下室加入600 μ L 20%胎牛血清的DMEM/高糖培養基，放入培養箱內24 h后取出，棄去上室內液體，PBS浸洗2次，預冷的甲醇固定30 min，倒置晾干后0.1%結晶紫染色30 min，PBS洗滌3次，拭去上室內未遷移細胞、風干。倒置顯微鏡下隨機取6個視野（×400）照相，計數每個視野的穿膜細胞數，取平均值。

1.2.7 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力：-20℃保存的Matrigel膠在4 ℃冰箱過夜融化。在冰上用預冷的槍頭將Matrigel膠與培養基按1∶5稀釋后，取60 μ L包被Transwell小室基底膜，37 ℃放置1.5 h待Matrigel膠凝固。細胞處理同遷移實驗，24 h后固定、染色，拭去上室內的Matrigel膠及未侵襲的細胞、風干。倒置顯微鏡下隨機取6個視野（×400）照相，計數每個視野的穿膜細胞數，取平均值。

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行分析，數據以x-±s表示，組間比較采用t檢驗。P ＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 A431細胞和HaCaT細胞中HOTAIR 的表達情況

采用實時熒光定量PCR檢測2種細胞中HOTAIR的表達，結果顯示，HOTAIR在A431細胞中的表達水平為HaCaT細胞的（3.69±0.29）倍，顯著高于HaCaT細胞，差異有統計學意義（P = 0.004）。選擇沉默A431細胞的HOTAIR表達進行后續研究。

2.2 HOTAIR siRNA在A431細胞中的轉染效率

采用實時熒光定量PCR檢測HOTAIR siRNA在A431細胞中的轉染效率，結果顯示，相對于A431組，A431-NC組和A431-siHOTAIR組的HOTAIR表達水平分別為0.99±0.03（P =0.648）和0.34±0.02（P ＜0.001）；A431-siHOTAIR組和A431-NC組間比較亦存在統計學差異（P ＜ 0.001）。提示特異性HOTAIR siRNA在A431細胞中下調HOTAIR表達效果顯著。

2.3 下調HOTAIR表達對A431細胞增殖的影響

轉染24 h時A431-siHOTAIR組與A431組和A431-NC組相比細胞活性變化不明顯，48 h開始A431-si-HOTAIR組細胞活性明顯低于A431組和A431-NC組（P均＜0.05）；而A431組和A431-NC組比較，24、48和72 h的細胞活性均無統計學差異（P均＞0.05），見圖1。說明HOTAIR下調抑制A431細胞增殖。

2.4 下調HOTAIR表達對A431細胞凋亡的影響

A431-siHOTAIR組、A431組及A431-NC組細胞早期凋亡率分別為（5.51±1.28）%、（3.05±0.27）%和（3.77±0.90）%，A431-siHOTAIR組與A431組及A431-NC組比較凋亡率增加（P = 0.020，P = 0.012），見圖2。提示HOTAIR下調促進A431細胞凋亡。

2.5 下調HOTAIR表達對A431細胞遷移及侵襲的影響

圖1 CCK-8檢測HOTAIR siRNA轉染后A431細胞的增殖Fig.1 Effect of HOTAIR siRNA on A431 cell proliferation detected by CCK-8 assay

用Transwell實驗檢測轉染后各組細胞的遷移、侵襲能力，結果顯示，與A431-NC組及A431組相比，A431-siHOTAIR組細胞遷移力和侵襲力明顯降低（P均＜0.05），而A431組與A431-NC組相比，細胞遷移力和侵襲力無明顯變化（P均＞0.05），見圖3、4。

圖2 流式細胞術檢測HOTAIR siRNA對A431細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of HOTAIR siRNA on A431 cell apoptosis detected by flow cytometry

圖3 Transwell實驗檢測HOTAIR siRNA對A431細胞遷移能力的影響 ×400Fig.3 Transwell assay showing the effect of HOTAIR siRNA on A431 cell migration ability ×400

3 討論

圖4 Transwell實驗檢測HOTAIR siRNA對A431細胞侵襲能力的影響 ×400Fig.4 Transwell assay showing the effect of HOTAIR siRNA on A431 cell invasion ability ×400

外陰鱗癌較罕見，但惡性程度高，晚期患者5年生存率不超過20%［1］。在治療上以手術切除為主，傳統的根治性手術需切除廣泛外陰及腹股溝淋巴結，損傷范圍大，圍術期與術后近、遠期并發癥均多。據報道，行根治術后有89%的患者發生不同程度的性功能障礙［5］，腹股溝淋巴結切除術后非性功能相關的近、遠期并發癥發生率高達84%［6］。雖然婦產科醫生和學者們根據外陰癌病變特點及淋巴結轉移規律，在改進手術方式方面做出了巨大努力，探索出多種改良型新手術方式，術后并發癥有所下降，但仍居高不下。因此，近年來外陰癌的治療傾向于縮小手術范圍，早期患者以局部手術為主，中晚期重視手術聯合放療、手術聯合化療、靶向治療等綜合治療及個體化治療的應用，以提高患者治療后生活質量［2-3］。也有學者開始注重術前治療特別是術前同步放化療的研究。MICHELETTI等［7］提出，當前浸潤性外陰癌標準的根治性、致殘性手術正逐漸被保守和個體化治療所取代。

隨著基因組學與蛋白質組學的發展，已發現外陰鱗癌內上千種lncRNA、miRNA、mRNA及蛋白質的表達水平存在差異。lncRNA是一組轉錄本長度超過200個核苷酸的ncRNA，在表觀遺傳水平、轉錄水平及轉錄后水平多個層面調控基因表達，參與細胞分化和個體發育等［8］。大量研究表明lncRNA在神經系統疾病、心血管疾病和腫瘤等危害人類健康的重大疾病中扮演重要角色，尤與腫瘤性疾病相關，成為學者關注的熱點；其中lncRNA HOTAIR是目前認識較為深入的一種，研究［9］顯示其幾乎在機體各系統的腫瘤中都存在表達上調，并與腫瘤發生、侵襲轉移、預后等密切相關，在調控腫瘤細胞的惡性生物學行為中發揮重要的促癌作用。本研究結果顯示，外陰鱗癌A431細胞中HOTAIR的表達水平顯著高于正常表皮HaCaT細胞，轉染HOTAIR siRNA后的A431細胞中HOTAIR表達顯著下調，明顯低于空白對照組及轉染陰性對照組，提示特異性HOTAIR siRNA能有效下調A431細胞HOTAIR的表達。

腫瘤的發生是細胞增殖與凋亡失衡的結果，癌基因常常通過直接或間接誘發細胞惡性增殖和（或）抵抗凋亡起促癌作用。QIU等［10］證實下調腫瘤細胞HOTAIR表達，CDK、Cyclin等多種細胞周期相關基因的表達水平發生變化，同時促細胞凋亡基因caspase-3、casepase-9等表達水平升高，抗凋亡基因Bcl-2的表達水平下降。本研究采取CCK-8法檢測下調A431細胞HOTAIR表達水平后A431細胞的增殖情況，結果顯示HOTAIR-siRNA轉染組細胞在48～72 h生長速度低于空白對照組及轉染陰性對照組；流式細胞術檢測細胞凋亡結果顯示HOTAIR siRNA轉染組細胞的凋亡率較對照組有所增加，提示HOTAIR表達下調能一定程度上抑制A431細胞增殖、促進A431細胞凋亡。

侵襲與轉移是惡性腫瘤最本質的特征，也往往預示腫瘤患者預后不良，嚴重危害人類生命健康。GUPTA等［11］發現HOTAIR表達水平在正常乳腺組織、乳腺癌原位癌和轉移性乳腺癌手術標本中表達差異顯著。過表達乳腺癌MDA-MB-231細胞中HOTAIR表達可以增加裸鼠腫瘤肺轉移的機會，而HOTAIR在原位乳腺癌中的表達水平只有發生肺轉移的組織中的十分之一。下調MDA-MB-231細胞中的HOTAIR表達明顯抑制腫瘤肺轉移的可能［11］。LIU等［12］報道下調非小細胞肺癌細胞的HOTAIR表達后細胞MMP-2、MMP-9的表達受抑制，最終抑制腫瘤細胞的侵襲轉移。HOTAIR還參與腫瘤細胞的上皮間質轉化，沉默HOTAIR表達腫瘤細胞上皮間質轉化受到抑制［12-13］。本研究中Transwell遷移、侵襲實驗結果顯示，HOTAIR siRNA轉染組細胞穿過Transwell小室基底膜的細胞數明顯減少，表明HOTAIR可能促進A431細胞的遷移、侵襲能力，沉默HOTIAR明顯降低A431細胞這方面能力。

綜上所述，lncRNA HOTAIR基因下調能夠抑制外陰鱗癌細胞A431的增殖、遷移和侵襲能力并促進細胞凋亡，提示HOTAIR可能對外陰鱗癌發展起促進作用，且在其浸潤轉移中作用可能更為明顯。但HOTAIR影響外陰鱗癌細胞的生物學行為及其機制，還需要聯合其他細胞系進行驗證并深入研究。希望目前的研究為進一步探究HOTAIR在外陰鱗癌發生發展中的作用提供參考，并為外陰鱗癌的靶向治療提供初步理論基礎。

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（編輯 陳 姜）

Effects of Long Non-coding RNA HOTAIR on the Biological Behaviors of Vulvar Squamous Cell Carcinoma A431 Cells

ZHAO Xiaoyu，CHENG Rongrong，OUYANG Ling
（Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the effects of long non-coding RNA （lncRNA） HOTAIR on the biological behavior of the vulvar squamous cell carcinoma A431 cells.MethodsThe expression level of HOTAIR in vulvar squamous cell carcinoma A431 cells and normal epidermis HaCaT cells were detected by real-time PCR. A431 cells were transfected with HOTAIR siRNA，then the proliferation，apoptosis，migration activities，and invasion activities were measured by CCK-8 assay，flow cytometry assay，transwell chamber migration test，and transwell chamber invasion test，respectively.ResultsAfter down-regulating the level of HOTAIR in A431 cells，the cell proliferation，migration，and invasion abilities were decreased （P ＜ 0.05），while the cell apoptosis rate was increased （P ＜ 0.05）.ConclusionlncRNA HOTAIR may play an important role in the proliferation，apoptosis，migration，and invasion in vulvar squamous cell carcinoma.

vulvar squamous cell carcinoma； HOTAIR； siRNA； biological behavior

R737.35

A

0258-4646（2017）11-0990-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.11.007

遼寧省教育廳科學研究一般項目（L2015585）；沈陽市科學技術計劃（P15-199-1-34）

趙曉宇（1987-），女，碩士研究生.

歐陽玲，E-mail：ouyang1964@163.com

2017-04-05

網絡出版時間：