Let-7b對骨髓基質干細胞誘導分化為神經元的作用研究

李進領，李 智，李 琳，張 靜，賈延劼，安 穎

1.450007河南省鄭州市，鄭州大學附屬鄭州中心醫院神經內科 2.119991俄羅斯莫斯科，莫斯科國立謝東諾夫第一醫科大學 3.450052河南省鄭州市，鄭州大學第一附屬醫院神經內科

·論著·

*通信作者：張靜，主治醫師；E-mail：yzkl0112@163.com

Let-7b對骨髓基質干細胞誘導分化為神經元的作用研究

李進領1，李 智2，李 琳1，張 靜3*，賈延劼3，安 穎1

1.450007河南省鄭州市，鄭州大學附屬鄭州中心醫院神經內科 2.119991俄羅斯莫斯科，莫斯科國立謝東諾夫第一醫科大學 3.450052河南省鄭州市，鄭州大學第一附屬醫院神經內科

目的探討Let-7b在大鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)分化為神經元過程中的作用。方法2013年1—12月將80只SPF級SD大鼠隨機分為空白對照組、陰性對照組、Let-7b-up慢病毒載體(LV-rno-Let-7b-up)組、Let-7b-inhibition慢病毒載體(LV-rno-Let-7b-inhibition)組，每組20只。將陰性對照組、LV-rno-Let-7b-up組、LV-rno-Let-7b-inhibition組大鼠分別感染EGFP空病毒，采用頸椎脫臼法處死4組大鼠，并獲取MSCs，傳代培養4代后備用。取傳代培養的MSCs感染慢病毒，具體為：空白對照組、陰性對照組不進行感染，LV-rno-Let-7b-up組、LV-rno-Let-7b-inhibition組分別感染LV-rno-Let-7b-up、Let-7b-inhibition，采用MTT法檢測感染前、感染后24 h、感染后5 d MSCs存活率。采用法舒地爾對4組進行誘導實驗，觀察MSCs分化為神經元的分化效率。采用免疫組化法檢測4組神經元烯醇化酶(NSE)、神經微管結合蛋白(MAP-2)、微管相關蛋白(Tau)水平，RT-PCR法檢測4組NSE、MAP-2、Tau mRNA水平。結果LV-rno-Let-7b-up組MSCs于LV-rno-Let-7b-up感染后第3天熒光表達最強，LV-rno-Let-7b-inhibition組MSCs于LV-rno-Let-7b-inhibition感染后第5天熒光表達最強。感染第5天時，陰性對照組、LV-rno-Let-7b-up組、LV-rno-Let-7b-inhibition組MSCs感染率分別為87.46%、86.81%、87.12%。感染后24 h、5 d陰性對照組、LV-rno-Let-7b-up組、LV-rno-Let-7b-inhibition組MSCs存活率低于空白對照組(P<0.05)；陰性對照組、LV-rno-Let-7b-up組、LV-rno-Let-7b-inhibition組感染后5 d MSCs存活率高于感染后24 h(P<0.05)。陰性對照組和空白對照組部分MSCs呈現神經元樣改變；LV-rno-Let-7b-up組極大部分MSCs出現典型的神經元樣結構；LV-rno-Let-7b-inhibition組僅有少量MSCs出現典型的神經元樣結構。LV-rno-Let-7b-up組NSE、MAP-2、Tau及其mRNA水平高于空白對照組、陰性對照組(P<0.05)；LV-rno-Let-7b-inhibition組NSE、MAP-2、Tau及其mRNA水平低于空白對照組、陰性對照組(P<0.05)。結論感染LV-rno-Let-7b-up后大鼠MSCs分化為神經元的分化效率增加，提示Let-7b可促進MSCs向神經元分化。

神經元；干細胞,骨髓；慢病毒屬；Let-7b；細胞分化

骨髓基質干細胞(MSCs)是骨髓中除造血干細胞外的具有高度可塑性的細胞群體，其在特定條件下可以分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞、神經元、骨骼肌細胞和心肌細胞[1-4]。MicroRNAs(miRNAs)是真核生物內發現的一種能起到調控作用的核苷酸單環非編碼RNA，其可以調控多種病理生理過程，包括細胞的增殖、分化、凋亡、神經元突觸形成、腫瘤發生等。miRNAs參與了所有動物的發生、發展和病理過程，其生物合成受嚴格的時間和空間控制。Let-7家族是較早發現的一類人類miRNAs，其可調控干細胞的生物學行為，與人類多種疾病的發生存在密切關系[5-10]，分為10個亞型,Let-7b為其中之一。由于Let-7b在大鼠MSCs分化為神經元過程中的作用機制尚不清楚，故本研究采用慢病毒載體感染MSCs，誘導、分化神經元，檢測神經元烯醇化酶(NSE)、神經微管結合蛋白(MAP)-2、微管相關蛋白(Tau)水平表達變化，探討Let-7b在MSCs分化為神經元過程中的作用，為MSCs的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及細胞 雌雄不限的SPF級SD大鼠80只，6～8周齡，體質量100～120 g，購自河南省實驗動物中心，許可證號：SCXK(豫)2010-0002。EGFP空病毒購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.1.2 實驗分組 將80只大鼠隨機分為空白對照組、陰性對照組、Let-7b-up慢病毒載體(LV-rno-Let-7b-up)組、Let-7b-inhibition慢病毒載體(LV-rno-Let-7b-inhibition)組，每組20只。

1.1.3 研究時間 2013年1—12月。

1.2 研究方法

1.2.1 獲取MSCs 4組大鼠常規飼養2周后，將陰性對照組、LV-rno-Let-7b-up組、LV-rno-Let-7b-inhibition組分別感染EGFP空病毒，采用頸椎脫臼法處死所有大鼠，于75%乙醇中浸泡5 min后從大鼠股骨和脛骨中獲取MSCs，48 h后半量換液，4 d后全換液，此后根據細胞生長情況每2～3 d換液1次繼續培養，當細胞融合度達80%～90%時再進行傳代。MSCs根據以上方法連續傳代培養4代后浸入液氮中備用。

1.2.2 LV-rno-Let-7b-up、LV-rno-Let-7b-inhibition感染 從液氮中取出4組傳代培養4代以上的大鼠MSCs，感染前18～24 h將貼壁細胞以1×105個/孔的密度接種至24孔板，培養2～3 d，直至細胞融合度達50%左右，按3個不同的最適感染復數(MOI)值(MOI=3、10、20)添加病毒液(LV-rno-Let-7b-up、Let-7b-inhibition)和終濃度為5 μg/ml的聚凝胺；即空白對照組、陰性對照組不進行感染，LV-rno-Let-7b-up組、LV-rno-Let-7b-inhibition組分別感染LV-rno-Let-7b-up、Let-7b-inhibition，培養24 h后換液。再培養48 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察各組感染情況，并采用MTT法檢測感染前、感染后24 h、感染后5 d MSCs存活率。

1.2.3 體外誘導MSCs分化為神經元 采用法舒地爾對各組細胞進行誘導實驗。取各組感染后的細胞進行誘導，待成活細胞熒光表達最強和細胞融合度達50%左右時，去除DMEM完全培養基，采用PBS沖洗3次(貼培養板孔壁緩慢加入，防止細胞脫壁)后，加入預誘導劑(DMEM+10%胎牛血清+200 μmol/L法舒地爾)置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養2 h，并于倒置熒光顯微鏡下觀察分化效率。

1.2.4 免疫組化法檢測NSE、MAP-2、Tau水平 將各組感染后并誘導分化2 h的細胞采用PBS沖洗3次，加入4%多聚甲醛1 ml固定，置于4 ℃冰箱過夜。次日吸出多聚甲醛，0.1% TBST緩沖液500 μl沖洗3次，3～5 min/次(或TBST緩沖液浸潤10 min)，用移液管吸出棄去。加入5%胎牛血清500 μl，封閉1 h，吸出封閉液，加稀釋后的一抗(1∶200)NSE抗體(1.0 mg/L)、MAP-2抗體(1.0 mg/L)、Tau抗體(1.0 mg/L)各500 μl，置于4 ℃冰箱過夜。棄除一抗，用0.1% TBST緩沖液500 μl沖洗3次，3～5 min/次。加稀釋后的二抗Cy3標記的山羊抗兔IgG(1∶200)500 μl，室溫下放置1 h。用移液管吸出二抗并棄去，0.1%TBST緩沖液500 μl沖洗3次。采用熒光顯微鏡進行觀察，應用Image Pro Plus 6.0進行圖像分析NSE、MAP-2、Tau水平。

1.2.5 采用RT-PCR法檢測NSE、MAP-2、Tau mRNA水平 參照Gotaq qPCR Master Mix (Promega)操作說明和1.5 Light Cycler RT-PCR系統(Roche)對cDNA進行PCR擴增。MAP-2上游引物為5′-CCACCCAGAAAACCTCATGA-3′，下游引物為5′-CATCCCGGTAAGTCCAATCA-3′；NSE上游引物為5′-TGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTT-3′，下游引物為5′-AACCACACAACCTACTACCTCA-3′；Tau上游引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應條件：94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，共30個循環，然后72 ℃延伸5 min，4 ℃靜置。采用相對定量法(2-ΔΔCt法)計算NSE、MAP-2、Tau mRNA水平。

2 結果

2.1 MSCs培養情況 體外傳代培養第2代MSCs呈扁圓形，體外培養第5代MSCs呈長梭形(見圖1，本文圖1～3彩圖見本刊官網www.chinagp.net電子期刊相應文章)。

2.2 LV-rno-Let-7b-up、LV-rno-Let-7b-inhibition感染情況 LV-rno-Let-7b-up組MSCs于LV-rno-Let-7b-up感染后第3天熒光表達最強，LV-rno-Let-7b-inhibition組MSCs于LV-rno-Let-7b-inhibition感染后第5天熒光表達最強。感染第5天時，陰性對照組、LV-rno-Let-7b-up組、LV-rno-Let-7b-inhibition組MSCs感染率分別為87.46%、86.81%、87.12%(見圖2)。

注：A為體外傳代培養第2代，B為體外傳代培養第5代

圖1 普通光學顯微鏡下MSCs形態(×200)

Figure1 MSCs morphology under the normal optical microscope

注：A為陰性對照組，B為Let-7b-up慢病毒載體(LV-rno-Let-7b-up)組，C為Let-7b-inhibition慢病毒載體(LV-rno-Let-7b-inhibition)組

圖2 熒光顯微鏡下感染第5天時MSCs形態(×200)

Figure2 Morphology of MSCs on the fifth day after infection under fluorescence microscopy

2.3 4組感染前后不同時間點MSCs存活率比較 4組感染前MSCs存活率比較，差異無統計學意義(P>0.05)；4組感染后24 h、感染后5 d MSCs存活率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；感染后24 h、5 d陰性對照組、LV-rno-Let-7b-up組、LV-rno-Let-7b-inhibition組MSCs存活率低于空白對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；陰性對照組、LV-rno-Let-7b-up組、LV-rno-Let-7b-inhibition組感染后5 d MSCs存活率高于感染后24 h，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.4 MSCs分化為神經元的分化效果 陰性對照組和空白對照組部分MSCs呈現神經元樣改變，發起多個分支，突起變長，胞體收縮，連接成網狀，且兩組分化效果相似；LV-rno-Let-7b-up組極大部分MSCs出現突起，胞體收縮，交織成網，形成典型的神經元樣結構；LV-rno-Let-7b-inhibition組僅有少量MSCs出現典型的神經元樣結構(見圖3)。

2.5 4組NSE、MAP-2、Tau水平比較 4組NSE、MAP-2、Tau水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；LV-rno-Let-7b-up組NSE、MAP-2、Tau水平高于空白對照組、陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；LV-rno-Let-7b-inhibition組NSE、MAP-2、Tau水平低于空白對照組、陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2、圖4)。

2.6 4組NSE、MAP-2、Tau mRNA水平比較 4組NSE、MAP-2、Tau mRNA水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；LV-rno-Let-7b-up組NSE、MAP-2、Tau mRNA水平高于空白對照組、陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；LV-rno-Let-7b-inhibition組NSE、MAP-2、Tau mRNA水平低于空白對照組、陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。

3 討論

MSCs在臨床研究中擁有廣泛的應用前景[11]。因MSCs為具備較強增殖、多向分化潛能的干細胞，在特定條件下能夠向內胚層、中胚層及外胚層分化，其作為供體細胞越來越多地應用于細胞治療及組織工程。作為供體細胞的MSCs具有幾個優勢：(1)相對易獲取；(2)體外培養時能快速增殖；(3)具有免疫耐受性或免疫無反應性；(4)可長時間存活并能與宿主體內的結構相整合；(5)能被穩定轉染，作為基因載體能長期表達外源性基因；(6)能夠自體移植，解決了免疫排斥的問題。臨床上已有將MSCs應用于阿爾茨海默病、多發性硬化的臨床治療[12-13]。1993年，LEE等[14]在秀麗新桿狀線蟲中首次發現了miRNAs，隨后miRNAs在MSCs生物學行為中的重要調控作用逐步顯現。miRNAs可經轉錄、表觀遺傳學調控基因組及異染色質形成等方式調控基因組的表達，參與MSCs重要生物學進程，包括增殖、分化、信號轉導、死亡等[15-17]。人類細胞中的Let-7可起到促進分化的重要作用[18-19]。Let-7參與多個信號通路[11,20-23]，其可通過不止一個環節抑制Insulin-磷脂酰肌醇 (PI3K)-mTOR通路，而后者參與了干細胞的增殖、神經分化和自噬。

表1 4組感染前、感染后24 h、感染后5 d MSCs存活率比較

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與感染后24 h比較，bP<0.05；LV-rno-Let-7b-up=Let-7b-up慢病毒載體，LV-rno-Let-7b-inhibition=Let-7b-inhibition慢病毒載體

表2 4組NSE、MAP-2、Tau水平比較

注：NSE=神經元烯醇化酶，MAP=神經微管結合蛋白，Tau=微管相關蛋白；與空白對照組比較，aP<0.05；與陰性對照組比較，bP<0.05

注：A為空白對照組，B為陰性對照組，C為LV-rno-Let-7b-up組，D為LV-rno-Let-7b-inhibition組

圖3 熒光顯微鏡下誘導分化2 h后MSCs形態(×200)

Figure3 MSCs morphology at 2 h after inducement and differentiation under fluorescence microscopy

注：A為空白對照組，B為陰性對照組，C為LV-rno-Let-7b-up組，D為LV-rno-Let-7b-inhibition組

圖4 熒光顯微鏡下4組MAP-2表達情況(免疫組化染色，×200)

Figure4 Expression level of MAP-2 in the 4 groups under fluorescence microscopy

表3 4組NSE、MAP-2、Tau mRNA水平比較

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與陰性對照組比較，bP<0.05

NSE是一種糖酵解酶，特異性地存在于神經元及神經內分泌細胞中。近年來，NSE成為神經元損傷的敏感性、特異性標志物[24]。MAP是細胞骨架中微管主干蛋白之外的一些蛋白成分，其中Tau主要見于中樞神經系統的神經元中，且少見于其他細胞，可作為神經軸突的標志分子[25]。MAP-2是構成神經元骨架的重要蛋白,參與形成細胞內的絲網狀結構,維持細胞形態,是原始神經上皮中所表達的最早的神經元標志物之一，并廣泛應用于神經生物學研究[26]。

Let-7b作為Let-7家族成員之一，其在MSCs分化為神經元過程中的作用目前尚不清楚。本研究采用Let-7b過表達和抑制慢病毒載體感染MSCs，觀察Let-7b在MSCs誘導分化中的作用。YU等[27]發現，Let-7家族在胚胎干細胞分化為神經前體細胞后，其水平急劇增加，并占主導地位，說明Let-7參與調控神經干細胞分化。本研究結果顯示，空白對照組、陰性對照組、LV-rno-Let-7b-up組、LV-rno-Let-7b-inhibition組感染前MSCs存活率無差異，感染后24 h、感染后5 d MSCs存活率有差異,表明Let-7b可以高效感染大鼠MSCs，感染后EGFP可穩定表達。MTT法檢測結果顯示，感染Let-7b后MSCs存活率下降，免疫組化結果顯示，MSCs感染Let-7b后神經元分化效率明顯提高，神經元的早、中期標志物NSE和成熟神經元特異性標志物MAP-2水平均顯著增高。考慮Let-7b可能在MSCs橫向分化為神經元過程中起作用，提高Let-7b水平，可促進MSCs向神經元分化。本研究結果顯示，單獨感染Let-7b并不能使MSCs分化為神經元，必須在法舒地爾作為誘導劑的條件下MSCs才能分化神經元，表明Let-7b在MSCs橫向分化為神經元過程中的作用不是唯一的，可能是對某一些信號途徑控制，如TLR信號通路、Wnt信號通路、Hmga2信號通路等，從而提高誘導效率。

由于本研究未進行MSCs體內移植實驗，MSCs在體內存活率及分化為神經元的效率也未得到研究，異體移植所引起的免疫排斥反應如何也未研究。本課題組擬在后續實驗中繼續觀察感染的MSCs體內存活率、細胞分化效率及免疫排斥反應，進一步探討Let-7b慢病毒載體感染MSCs后移植入大鼠體內所產生各種反應的分子機制。

綜上所述，感染LV-rno-Let-7b-up能加快MSCs分化為神經元的分化效率，同時其NSE、MAP-2、Tau水平亦升高，本結果可為干細胞的臨床試驗提供一定的理論依據。

作者貢獻：李進領資進行料收集整理，撰寫論文；李智、安穎對論文進行校對，并負責英文潤色；李琳進行實驗實施、評估、資料收集；張靜進行實驗設計與實施、資料收集整理，撰寫論文；賈延劼進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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EffectofLet-7bontheDifferentiationofBoneMarrowMesenchymalStemCellsintoNerveCells

LIJin-ling1,LIZhi2，LILin1,ZHANGJing3*,JIAYan-jie3，ANYing1

1.DepartmentofNeurology，ZhengzhouCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,Zhengzhou450007，China2.I.M.SechenovFirstMoscowStateMedicalUniversity,Moscow119991,Russia3.DepartmentofNeurology，theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052，China

*Correspondingauthor:ZHANGJing，Attendingphysician；E-mail：yzkl0112@163.com

ObjectiveTo investigate the role of Let-7b in the differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) into neurons.MethodsThis study was conducted in 2013.Eighty SPF grade SD rats were randomly divided into blank control group,negative control group,Let-7b-up lentiviral vector (LV-rno-Let-7b-up) group,Let-7b-inhibition lentiviral vector (LV-rno-Let-7b-inhibition) group,20 rats in each group.The negative control group,LV-rno-Let-7b-up group,LV-rno-Let-7b-inhibition group were injected EGFP blank virus respectively.Four groups of rats were sacrificed by cervical dislocation,and MSCs were obtained and cultured for 4 generations.Subculture of MSCs were infected with lentivirus,that is,the blank control group and the negative control group were not infected,LV-rno-Let-7b-up group,LV-rno-Let-7b-inhibition group were infected with LV-rno-Let-7b-up,Let-7b-inhibition,respectively.The survival rate of MSCs was detected by MTT before infection,at 24 h after infection,on the fifth day after infection.Four groups were induced by fasudil,and the differentiation efficiency of MSCs into neurons was observed.The levels of NSE,MAP-2 and Tau were detected by immunohistochemistry.The levels of NSE mRNA,MAP-2 mRNA and Tau mRNA were detected by RT-PCR.ResultsThe MSCs of LV-rno-Let-7b-up group had the strongest fluorescence expression on the third day after LV-rno-Let-7b-up infection.The MSCs of LV-rno-Let-7b-inhibition group had the strongest fluorescent expression on the fifth day after LV-rno-7b-inhibition infection.On the fifth day after infection,the MSCs infection rates of the negative control group,LV-rno-Let-7b-up group and LV-rno-Let-7b-inhibition group were 87.46%,86.81% and 87.12%,respectively.At 24 h after infection，and on the fifth day after infection the blank control group presented higher survival rate of MSCs than the other three groups (P<0.05).The survival rate of MSCs on the fifth day after infection was found to be higher than that at 24 h after infection in the negative control group,LV-rno-Let-7b-up group and LV-rno-Let-7b-inhibition group (P<0.05).Some MSCs showed neuronal changes in the negative control group and the blank control group,almost all the MSCs showed typical neuron-like structures in LV-rno-Let-7b-up group,but only a small number of MSCs showed a typical neuron-like structure in the LV-rno-Let-7b-inhibition group.The protein and mRNA levels of NSE,MAP-2,Tau in LV-rno-Let-7b-up group were higher than those in blank control group and negative control group(P <0.05);the protein and mRNA levels of NSE,MAP-2,Tau in LV-rno-Let-7b-inhibition group were lower than those in blank control group and negative control group (P<0.05).ConclusionWe found that the differentiation efficiency of MSCs into neurons was increased after infection with LV-rno-Let-7b-up，which suggests that Let-7b promotes the differentiation of MSCs into neurons.

Neurons；Stem cells,myeloid；Lentivirus；Let-7b；Cell differentiation

國家自然科學基金資助項目(81071114，81371385)

R 322.8 R 329.24

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.00.122

李進領，李智，李琳，等.Let-7b對骨髓基質干細胞誘導分化為神經元的作用研究[J].中國全科醫學，2017，20(33)：4156-4161.[www.chinagp.net]

LI J L,LI Z，LI L,et al.Effect of Let-7b on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into nerve cells[J].Chinese General Practice，2017，20(33)：4156-4161.

2017-03-03；

2017-07-21)

(本文編輯：毛亞敏)