HPLC法同時測定痰熱清膠囊中7種成分的含量Δ

張振華，鐘蘋蘋，徐英（1.上海凱寶藥業股份有限公司，上海01401；.上海中醫藥大學中藥學院，上海0103；3.上海中藥標準化研究中心，上海0103）

HPLC法同時測定痰熱清膠囊中7種成分的含量Δ

張振華1＊，鐘蘋蘋2，徐英1，3#（1.上海凱寶藥業股份有限公司，上海201401；2.上海中醫藥大學中藥學院，上海201203；3.上海中藥標準化研究中心，上海201203）

目的：建立同時測定痰熱清膠囊中7種成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Ultimate XB C18，流動相為乙腈-0.2%甲酸溶液（梯度洗脫），流速為0.8 mL/min，檢測波長為325 nm，柱溫為35℃，進樣量為10 μL。結果：綠原酸、異連翹酯苷A、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C和黃芩苷檢測進樣量線性范圍分別為0.025～0.5 μg（r＝0.999 6）、0.025～0.5 μg（r＝0.999 7）、0.050～1.0 μg（r＝0.999 9）、0.025～0.5 μg（r＝0.999 7）、0.025～0.5 μg（r＝0.999 6）、0.025～0.5 μg（r＝0.999 6）和0.750～1.5 μg（r＝0.999 9）；定量限均≤1.5 ng，檢測限均為0.5 ng；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜3.0%；加樣回收率為95.28%～106.30%（RSD為0.97%～2.14%，n＝9）。結論：該方法操作簡便，精密度、穩定性、重復性好，可用于痰熱清膠囊中7種成分含量的同時測定。

痰熱清膠囊；綠原酸；異連翹酯苷A；連翹酯苷A；異綠原酸；黃芩苷；高效液相色譜法；含量測定

和漢黃芩苷等黃酮類成分[4-8]，牛磺熊去氧膽酸和熊去氧膽酸等膽汁酸類成分[9-11]，氨基酸、有機酸、苯乙醇苷類和木脂素類成分等[12-17]。該制劑現行國家標準的指標性成分為黃芩苷和熊去氧膽酸，尚無針對其他化學成分的分析和報道。因此，本試驗采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定痰熱清膠囊中綠原酸、異連翹酯苷A、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C和黃芩苷7種成分含量，以為更好地控制該制劑質量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括在線脫氣裝置、柱溫箱、自動進樣器、二極管陣列檢測器、Agilent化學工作站（美國Agilent公司）；BT25S型電子分析天平（德國Sartorius公司）；Vortex Mixer型渦旋儀（美國Labnet公司）；KQ-250DB型數控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

痰熱清膠囊（上海凱寶藥業股份有限公司，批號：1406101、1407101、1407102，規格：0.4 g/粒）；綠原酸對照品（批號：140601）、異連翹酯苷A對照品（批號：Y-184-140801）、連翹酯苷A對照品（批號：L-012-140730）、異綠原酸B對照品（批號：Y-069-141122-1）、異綠原酸A對照品（批號：140615）、異綠原酸C對照品（批號：Y-070-140801）、黃芩苷對照品（批號：150517）均購自上海欣拓貿易有限公司，純度均≥98%；乙腈、甲醇、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，10%A；10～20 min，10%→13%A；20～25 min，13%→18%A；25～50 min，18%A；50～55 min，18%→25%A；55～60 min，25%→85%A；60～70 min，85%→90%A；70～80 min，90%A）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：325 nm；柱溫：35℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液取待測成分對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成綠原酸、異連翹酯苷A、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷質量濃度分別為50、50、100、50、50、50、1 500 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液取樣品內容物適量，研細，混勻，取約25 mg，精密稱定，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，密塞，稱定質量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）處理15 min，放冷，再次稱定質量，加甲醇補足減失的質量，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液按痰熱清膠囊處方和工藝制備缺黃芩、金銀花和連翹的陰性樣品，并按“2.2.2”項下方法制成陰性對照溶液。

2.3 系統適用性試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結果，理論板數以黃芩苷峰計為30 000；分離度＞1.5，各成分基線分離良好。

2.4 線性關系考察

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL，分別置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，制成系列混合對照品溶液。精密量取上述系列混合對照品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

表1 回歸方程、線性范圍與定量限、檢測限（n＝6）Tab 1 Regression equations，linear ranges，quantitation limits and detection limits（n＝6）

2.5 定量限與檢測限考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項下色譜條件進樣測定，當信噪比為10∶1時，得定量限；當信噪比為3∶1時，得檢測限，詳見表1。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，綠原酸、異連翹酯苷A、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷峰面積的RSD分別為1.78%、1.27%、1.83%、1.76%、1.92%、1.03%、0.53%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：1406101）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，綠原酸、異連翹酯苷A、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷峰面積的RSD分別為1.19%、1.09%、1.69%、0.93%、1.35%、1.81%、1.16%（n＝6），表明供試品溶液室溫放置24 h內基本穩定。

2.8 重復性試驗

精密稱取同一批樣品（批號：1406101）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結果，綠原酸、異連翹酯苷A、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷含量的平均值分別為0.40%、0.47%、0.99%、0.33%、0.22%、0.40%、19.20%，RSD分別為2.35%、1.63%、1.75%、2.04%、2.51%、1.83%、1.38%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量樣品（批號：1406101）適量，共9份，分別加入低、中、高質量的待測成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

2.10 樣品含量測定

表2 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests（n＝9）

續表2Continued Tab 2

分別取3批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（n＝3，%）Tab 3 Results of content determination of samples（n＝3，%）

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的考察

3.1.1 提取溶劑的選擇筆者分別考察了甲醇、50%甲醇溶液、70%甲醇溶液和水4種不同提取溶劑對痰熱清膠囊提取效果的影響。結果表明，70%甲醇溶液對異連翹酯苷A、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的提取效果最好，水對綠原酸的提取效果最好，甲醇對黃芩苷的提取效果最好。鑒于痰熱清膠囊中7種成分含量最高的是黃芩苷，同時考慮到制備方法的簡便性，本試驗選擇甲醇作為提取溶劑。

3.1.2 提取時間的選擇筆者分別考察了5、10、15、20、25、30 min 6種不同提取時間對痰熱清膠囊提取效果的影響。結果表明，綠原酸、異連翹酯苷A、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷含量均隨著提取時間的增加，呈先增后減的趨勢。超聲提取時間過長或過短均不利于樣品中7種成分的提取，而且當提取時間為15 min時7種成分的整體提取效果最佳。因此，超聲提取時間選定為15 min。

3.1.3 溶劑量的考察預試驗中，筆者取樣品內容物的粉末約25 mg，精密稱定，置于不同規格的量瓶中，分別加入5、10、25 mL的甲醇，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄各成分的峰面積。結果表明，提取溶劑為5 mL時7種成分的峰面積分別為提取溶劑為10、25 mL時的峰面積的2、5倍，同時考慮節省溶劑并綠色環保的原則，選擇提取溶劑甲醇的量為5 mL。

3.2 色譜條件的優化

3.2.1 檢測波長的選擇筆者分別考察了280、290、300、310、325、330、340 nm 7種不同波長下7種成分的吸光度。結果，隨著檢測波長的增加，綠原酸、異連翹酯苷A、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的吸光度均呈先增后減的趨勢，而黃芩苷則呈遞減的趨勢，鑒于黃芩苷在痰熱清膠囊中含量較高，為了提高低含量成分的檢測結果的準確度，宜選擇較大的波長。經分析，發現當波長為325 nm時，綠原酸、異連翹酯苷A、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的吸光度最大，能較好地反映出樣品中7種成分的整體含量。因此，選擇325 nm為檢測波長。

3.2.2 色譜柱的選擇筆者分別考察了3種不同色譜柱Ultimate XB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Phenomenex Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Zorbax SB C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）對供試品溶液的分離效果。結果表明，Ultimate XB C18色譜柱分離效果優于其他兩種色譜柱。因此，選擇Ultimate XB C18為分析色譜柱。

3.2.3 流動相系統的選擇筆者分別考察了乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.2%甲酸溶液、乙腈-0.3%甲酸溶液（梯度洗脫）3種不同流動相系統對供試品溶液的分離效果。結果表明，采用乙腈-0.2%甲酸溶液（梯度洗脫）為流動相系統時，峰形較好，保留時間適中，基線較平穩。因此，選擇乙腈-0.2%甲酸溶液（梯度洗脫）作為分析流動相系統。

3.2.4 柱溫的選擇筆者分別考察了25、30、35、40℃4種不同柱溫對供試品溶液的分離效果。結果表明，當柱溫為35℃時，7種成分分布較均勻，整體分離度最好，基線比較平穩。因此，柱溫選定為35℃。

3.2.5 流速的選擇筆者分別考察了0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min 4種不同流速對供試品溶液的分離效果。結果表明，當流速為0.8 mL/min時，7種成分整體分離度最好。因此，流速選擇為0.8 mL/min。

3.3 樣品含量測定結果分析

3批樣品含量測定結果表明，7種成分中黃芩苷含量最高，分別為19.20%、19.09%、18.58%，均符合現有痰熱清膠囊國家標準中“本品每粒（0.4 g/粒）含黃芩以黃芩苷計，不得少于60 mg”（即黃芩苷含量不得少于15%）的規定；且3批樣品黃芩苷含量的RSD為1.75%，說明黃芩苷含量的批間差異較小。

3批樣品中來自金銀花的綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的平均含量分別為0.40%、0.34%、0.24%、0.41%，共計1.39%；來自連翹的異連翹酯苷A、連翹酯苷A的平均含量分別為0.55%、1.13%，共計1.68%。鑒于這6種成分的含量均較低，含量測定結果誤差較大，因此在建立痰熱清膠囊質量標準中含量測定部分時，可以考慮以金銀花中有機酸類成分總量、連翹中苯乙醇苷類成分總量作為含量測定指標。

綜上所述，本方法操作簡便，精密度、穩定性、重復性好，可用于痰熱清膠囊中7種成分含量的同時測定。

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Simultaneous Determination of 7 Components in Tanreqing Capsules by HPLC

ZHANG Zhenhua1，ZHONG Pingping2，XU Ying1，3（1.Shanghai Kaibao Parmaceutical Co.，Ltd.，Shanghai 201401，China；2.College of TCM，Shanghai University of TCM，Shanghai 201203，China；3.Shanghai Research Center for TCM Standardization，Shanghai 201203，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of 7 components in Tanreqing capsules.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Ultimate XB C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2%formic acid（gradient elution）at a flow rate of 0.8 mL/min.The detection wavelength was set at 325 nm，and column temperature was 35℃.The sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges of chlorogenic acid，isoforsythiaside A，forsythiaside A，isochlorogenic acid B，isochlorogenic acid A，isochlorogenic acid C and baicalin were 0.025-0.5 μg（r＝0.999 6），0.025-0.5 μg（r＝0.999 7），0.050-1.0 μg（r＝0.999 9），0.025-0.5 μg（（r＝0.999 7），0.025-0.5 μg（（r＝0.999 6），0.025-0.5 μg（r＝0.999 6），0.750-1.5 μg（r＝0.999 9），respectively.The limit of quantitation was no more than 1.5 ng，and the limit of detection was 0.5 ng.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 3.0%.The recoveries were 95.28%-106.30%（RSD ranged 0.97%-2.14%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is simple，precise，stable and reproducible，and can be used for simultaneous determination of 7 components in Tanreqing capsules.

Tanreqing capsules；Chlorogenic acid；Isoforsythiaside A；Forsythiaside A；Isochlorogenic acid；Baicalin；HPLC；Content determination

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2017）30-4256-05

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.30.21

痰熱清膠囊是由黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花和連翹等5味中藥材組合而成的中藥復方制劑，具有疏風清熱、化痰解毒的功效[1-3]。現代藥理學研究表明，痰熱清膠囊的主要成分包括黃芩苷

國家自然科學基金資助項目（No.81403089）

＊質量工程師。研究方向：中藥質量控制。E-mail：kbzzh@sina.com

#通信作者：助理研究員，博士。研究方向：藥物分析及新藥研發。E-mail：skyxu_1983@163.com

2016-11-18

2017-01-16）

（編輯：張靜）