苗藥朱砂根的HPLC指紋圖譜研究Δ

孫緒，姚成芬，付思紅，鞏仔鵬，劉亭，楊暢，查俊，李勇軍#（.貴州省藥物制劑重點實驗室，貴陽550004；2.貴州醫科大學藥學院，貴陽550004；.民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心/國家苗藥工程技術研究中心，貴陽550004）

苗藥朱砂根的HPLC指紋圖譜研究Δ

孫緒1，2＊，姚成芬1，3，付思紅1，3，鞏仔鵬1，劉亭1，楊暢1，查俊3，李勇軍3#（1.貴州省藥物制劑重點實驗室，貴陽550004；2.貴州醫科大學藥學院，貴陽550004；3.民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心/國家苗藥工程技術研究中心，貴陽550004）

目的：建立苗藥朱砂根的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法：采用HPLC法。色譜柱為Diamonsil C18，流動相為甲醇-水（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為220 nm，柱溫為30℃，進樣量為10 μL。以11-O-（3，′4，′5′-三羥基沒食子酰基）-巖白菜素為參照，測定16批藥材樣品的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版）進行共有峰指認和相似度評價，并就指紋圖譜進行聚類分析。結果：16批朱砂根藥材的HPLC圖譜有6個共有峰，其中8批藥材樣品的相似度均＞0.9；16批朱砂根藥材可聚為4類。結論：該研究所建指紋圖譜可為朱砂根藥材的鑒別和質量評價提供參考。

朱砂根；高效液相色譜法；指紋圖譜；聚類分析

朱砂根又名八爪金龍，為紫金牛科植物朱砂根Ardisia crenata Sims.的干燥根及根莖，主要成分為三萜皂苷、鞣質、糖類等[1]，具清熱解毒、散瘀止痛、祛風除濕之功效，臨床多用于咽喉腫痛、扁桃體炎、風濕骨痛等癥的治療[2]，收載于2015年版《中國藥典》（一部）[3]和2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》[4]。2015年版《中國藥典》（一部）僅收載了朱砂根藥材中巖白菜素含量的測定方法，為進一步完善其質量標準，本課題組在前期研究[5]的基礎上收集了具有代表性的貴州省不同產地朱砂根藥材，采用分析效能高、速度快且應用較廣的高效液相色譜法（HPLC）建立了指紋圖譜[6-9]，并就結果進行了聚類分析。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包含二極管陣列檢測器、四元梯度泵、脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、ChemStation色譜工作站（美國Agilent公司）；Me AE240型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 試劑

巖白菜素、11-O-（3′，4′，5′-三羥基沒食子酰基）-巖白菜素對照品均為貴州省藥物制劑重點實驗室自制，經核磁共振、紅外光譜檢測，質譜分析確證其結構，經HPLC法檢測純度均＞98%；試驗所用試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

16批朱砂根藥材采自貴州省不同產地（見表1），由貴州醫科大學生藥學教研室龍慶德副教授鑒定為真品。

表1 朱砂根藥材來源Tab 1 The sources ofA.crenata

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～5 min，5%→15%A；5～10 min，15%→20%A；10～30 min，20%→40%A；30～45 min，40%→60%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：220 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液分別稱取待測成分對照品適

量，加甲醇制成巖白菜素、11-O-（3′，4′，5′-三羥基沒食子酰基）-巖白菜素質量濃度分別為0.496 4、1.061 0 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液取藥材樣品粉末（過40目篩）1 g，精密稱定，精密加甲醇25 mL，稱定質量，加熱回流提取2 h，放冷至室溫，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗取“2.2.2”項下供試品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，以11-O-（3′，4′，5′-三羥基沒食子酰基）-巖白菜素的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結果，6個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3.0%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S1）適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以11-O-（3′，4′，5′-三羥基沒食子酰基）-巖白菜素的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結果，6個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3.0%（n＝7），表明供試品溶液室溫放置24 h內基本穩定。

2.3.3 重復性試驗精密稱取同一批藥材樣品（編號：S1）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以11-O-（3′，4′，5′-三羥基沒食子酰基）-巖白菜素的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結果，6個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3.0%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成及相似度、共有峰相關分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成取16批藥材樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版）對16批藥材樣品的HPLC圖譜進行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

圖1 16批藥材樣品HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC superposed chromatograms of 16 batches of medicinal materials

2.4.2 相似度分析采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版）對16批藥材樣品的HPLC圖譜進行比較分析，詳見表2。結果，16批藥材樣品中有8批差異較小，相似度均＞0.9；另外4批藥材樣品相似度在0.7～0.9之間；還有4批藥材樣品相似度在0.2～0.4之間。表明不同產地朱砂根藥材化學成分差異較大。

圖2 藥材樣品HPLC對照指紋圖譜Fig 2 Control HPLC Fingerprint of samples

2.4.3 共有峰相關數據分析采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版）對16批藥材樣品的HPLC圖譜進行比較分析。結果，16批藥材樣品有6個共有峰，通過對照品HPLC圖譜確定4號峰為巖白菜素，5號峰為11-O-（3′，4′，5′-三羥基沒食子酰基）-巖白菜素。以5號峰為參照峰，計算其他共有峰與5號峰的相對保留時間和相對峰面積，詳見表3、表4。

表2 16批藥材樣品相似度評價結果Tab 2 Similarity evaluation of 16 batches of samples

表3 16批藥材樣品HPLC圖譜共有峰的相對保留時間Tab 3 Relative retention time of common peaks in HPLC fingerprints of 16 batches of samples

表4 16批藥材樣品HPLC圖譜共有峰的相對峰面積Tab 4 Relative peak areas of common peaks in n HPLC fingerprints of 16 batches of samples

2.5 聚類分析

就HPLC指紋圖譜中各共有峰峰面積進行標準化處理，采用SPSS 18.0統計軟件中系統聚類法（Hierarchical cluster）的Ward法中歐氏距離平方法（Squared euclidean distance）對16批藥材樣品進行系統聚類分析，繪制樹狀圖，詳見圖3。

圖3 16批藥材樣品的聚類分析樹狀圖Fig 3 Cluster analysis of 16 batch of medicinal materials samples

由圖3可知，16批不同產地藥材樣品在距離為5的條件下可以分為4類：第1類藥材樣品7批（S2、S9、S10、S11、S14、S15、S16），其相似度均＞0.9，此類藥材樣品中巖白菜素含量都普遍較高；第2類藥材樣品4批（S3、S4、S5、S7），相似度在0.2～0.4之間，此類藥材樣品中巖白菜素含量很低；第3類藥材樣品4批（S1、S6、S8、S13），相似度在0.7～0.9之間，此類藥材樣品中巖白菜素含量介于前2類之間；第4類藥材樣品1批（S12），雖然其相似度在0.9以上，但其2號共有峰含量明顯高于其他批藥材樣品，化學成分信息量也較為全面，因此聚為一類。

3 討論

本課題組采用HPLC法建立了苗藥朱砂根的指紋圖譜分析方法。試驗中對流動相、洗脫梯度、流速、柱溫等色譜條件進行了優化，在優化后的色譜條件下，各待測成分峰達到較好分離且基線平穩；并考察了提取方法、提取溶劑、提取時間等供試品溶液制備方法，得到了最適合的條件。方法學驗證結果表明，所建立的朱砂根藥材指紋圖譜分析方法準確、可靠。

相似度評價法是以兩者中若干共有的、具有特征的指標作為統一尺度，運用適當的判定原則來描述兩者之間匹配程度的方法[10-12]；聚類分析法是根據相似程度大小將樣品歸類，在中藥的真偽鑒別、質量評價及品種分類等方面均有應用[13-16]。本研究就所鑒定的16批朱砂根藥材樣品的指紋圖譜進行了相似度評價及聚類分析，由相似度評價結果可見，其中有4批藥材樣品相似度較低，差異較大，而造成該差異的主要因素是各共有峰含量的差異；聚類分析結果準確地將各批藥材歸類，達到了質量評價及品種分類的目的。

綜上所述，本研究所建指紋圖譜可為朱砂根藥材的鑒別和質量評價提供參考。

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Study on HPLC Fingerprint of Miao Medicine Ardisia crenata

SUN Xu1，2，YAO Chengfen1，3，FU Sihong1，3，GONG Zaipeng1，LIU Ting1，YANG Chang1，ZHA Jun3，LI Yongjun（31.Guizhou Provincial Key Lab of Pharmaceutic Preparation，Guiyang 550004，China；2.School of Pharmacy，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China；3.Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM，Ministry of Education/National Engineering Research Center of Miao Medicines，Guiyang 550004，China）

OBJECTIVE：To establish HPLC fingerprints of Miao medicine Ardisia crenata.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Diamonsil C18column with mobile phase consiste of methanol-water（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was 220 nm，and column temperature was maintained at 30℃.The sample size was 10 μL.Using 11-O-（3，′4，′5′-three-o-galloylhyperin）-bergeninum as reference，HPLC fingerprints of 16 batches of samples were determined.Common identification and similarity evaluation were performed by using TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation Software（2012 edition）.Cluster analysis of fingerprrints was conducted.RESULTS：There were 6 common peaks in HPLC fingerprints of 16 batches of samples.The similarity among 8 batches was more than 0.9.The 16 batches of samples could be clustered into 4 categories.CONCLUSIONS：Established fingerprints can provide reference for identification and quality evaluation of A.crenata.

Ardisia crenata；HPLC；Fingerprint；Cluster analysis

R284

A

1001-0408（2017）30-4285-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.30.29

貴州省科技計劃項目（No.黔科合平臺人才〔2016〕5613、5677）；貴州省教育廳項目（No.黔教合協同創新字〔2013〕04、黔科合KY字〔2013〕122、黔教研合ZYRC字〔2014〕012）；貴州省優秀青年科技人才培養對象專項（No.黔科合人字〔2015〕11號）

＊碩士研究生。研究方向：中藥藥效物質基礎及質量控制。電話：0851-86908468。E-mail：928763710@qq.com

#通信作者：教授。研究方向：天然產物活性。電話：0851-86908468。E-mail：liyongjun026@126.com

2017-01-10

2017-02-18）

（編輯：張靜）