HPLC-MS/MS法測定胸腺肽腸溶片中胸腺素α1的含量

邱新峰（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安慶醫(yī)院藥劑科，安徽安慶246003）

HPLC-MS/MS法測定胸腺肽腸溶片中胸腺素α1的含量

邱新峰＊（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安慶醫(yī)院藥劑科，安徽安慶246003）

目的：建立測定胸腺肽腸溶片中胸腺素α1含量的方法。方法：采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。色譜柱為Luna C1（82），流動相為0.1%甲酸-乙腈（梯度洗脫），流速為0.7 mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20μL；離子化模式為電噴霧電離，噴霧電壓為4.5 kV，鞘氣流速為60 arb，輔助氣流速為30 arb，吹掃氣流速為10 arb，毛細(xì)管溫度為320℃，工作模式為正離子監(jiān)測模式。結(jié)果：胸腺素α1檢測質(zhì)量濃度線性范圍為1～1 000 ng/mL（r＝0.999 9）；定量限為1 ng/mL，檢測限為0.1 ng/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率為95.0%～98.0%（RSD＝1.2%，n＝6）。結(jié)論：該方法簡單快速、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于胸腺肽腸溶片中胸腺素α1含量的測定。

胸腺肽腸溶片；胸腺素α1；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

胸腺肽為免疫調(diào)節(jié)藥，能調(diào)節(jié)和增強(qiáng)人體細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞成熟，增加T細(xì)胞上淋巴因子受體的水平[1-2]。胸腺肽抑制劑可用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急慢性肝炎等的治療，均取得較好的療效[3]；現(xiàn)有研究表明，其亦可用于腫瘤放化療引起的細(xì)胞免疫功能低下的輔助治療，以防止癌癥的擴(kuò)散、復(fù)發(fā)和新生[4-5]。胸腺肽腸溶片主要成分為從健康小牛胸腺中提取的具有生物活性的分子量小于6 000的多肽[6]，其中以胸腺素α1為主[7-8]。盡管胸腺肽制劑的臨床應(yīng)用比較廣泛，但是由于各生產(chǎn)廠家的制備工藝不同導(dǎo)致多肽組分及活性各有差異；這給臨床用藥帶來了巨大阻礙[9-10]。Q Exactive Plus型質(zhì)譜儀是一種新型四極桿和軌道阱雜交高分辨質(zhì)譜儀，其將高選擇性四極桿的離子過濾與靜電軌道阱質(zhì)譜高分辨準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)測量技術(shù)相結(jié)合，與傳統(tǒng)的多肽定量方法相比較，其在分辨率、掃描速度和靈敏度等性能上均有所提升，可以同時涵蓋蛋白質(zhì)組學(xué)的定量和定性需求。鑒于此，筆者采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）建立了測定胸腺肽腸溶片中胸腺素α1含量的方法，以期為完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Q Exactive Plus型質(zhì)譜儀，配有H-ESI源和Xcalibur 3.0數(shù)據(jù)處理軟件（美國Thermo Fisher公司）；Nexera LC-30A型HPLC系統(tǒng)，包括SIL-30AC型恒溫自動進(jìn)樣器、CTO-20AC型恒溫柱箱（日本Shimadzu公司）；Model A120S型電子分析天平（德國Sartorius公司）；Hettich ROTINA 38/38R型離心機(jī)（德國Hettich公司）；Branson 3510型超聲機(jī)（美國Branson公司）。

1.2 藥品與試劑

胸腺肽腸溶片（廠家1，批號：20150701，規(guī)格：5 mg/片；廠家2，批號：20141012，規(guī)格：20 mg/片；廠家3，批號：20150604，規(guī)格：10 mg/片；廠家4，批號：20150401，規(guī)格：5 mg/片）；胸腺素α1對照品（日本Sigma公司，批號：T3410，純度：99.8%）；乙腈、甲酸均為色譜純，水為實驗室自制純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗條件和系統(tǒng)適用性試驗

2.1.1 色譜條件色譜柱：Luna C18（2）（50 mm×2 mm，5μm）；流動相：0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～2 min，100%A；2～7 min，100%→95%A；7～8 min，95%→85%A；8～8.5 min，85%→95%A；8.5～10 min，95%→100%A）；流速：0.7 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件離子化模式：電噴霧電離；噴霧電壓：4.5 kV；鞘氣流速：60 arb；輔助氣流速：30 arb；吹掃氣流速：10 arb；毛細(xì)管溫度：320℃；工作模式：正離子監(jiān)測模式；最大離子注入時間：200 ms；掃描范圍：m/z 400～1 500。

在上述試驗條件下進(jìn)樣測定，理論板數(shù)按胸腺素α1計＞3 000，分離度＞1.5，色譜見圖1。

圖1 提取離子流圖Fig 1 Extraction ion flow diagram

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液精密稱取胸腺素α1對照品1 mg，置于10 mL量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液取樣品適量，除去腸溶衣，研細(xì)，置于10 mL量瓶中，加水制成一定質(zhì)量濃度溶液（廠家1和4的樣品制成質(zhì)量濃度為0.125 mg/mL，廠家2的樣品制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，廠家3的樣品制成質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL），超聲（功率：400 W，頻率：40 kHz，下同）處理30 min，然后在4℃下以半徑為5 cm、10 000 r/min離心10 min，取上清液，即得。

2.2.3 空白溶液以水為空白溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

取“2.2.1”項下對照品溶液適量，用水逐級稀釋制成胸腺素α1質(zhì)量濃度分別為1、10、100、500、1 000 ng/mL的系列對照品溶液。取上述系列對照品溶液各適量，按“2.1”項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以胸腺素α1質(zhì)量濃度（x，ng/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得胸腺素α1的回歸方程為y＝137 124x－67 985（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，胸腺素α1檢測質(zhì)量濃度線性范圍為1～1 000 ng/mL。

2.4 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

取“2.2.1”項下對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時，得LOQ；當(dāng)信噪比為3∶1時，得LOD。結(jié)果，胸腺素α1的LOQ為1 ng/mL，LOD為0.1 ng/mL。

2.5 精密度試驗

取“2.2.1”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下試驗條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，胸腺素α1峰面積的RSD＝0.12%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20150701）適量，分別于室溫下放置0、3、6、9、12、16 h時按“2.1”項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，胸腺素α1峰面積的RSD＝1.09%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗

取樣品（批號：20150701）適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，胸腺素α1峰面積的RSD＝0.61%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取樣品（批號：20150701）適量，置于10 mL量瓶中，加入一定質(zhì)量的胸腺素α1對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.9 樣品含量測定

取4批樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算胸腺素α1的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，ng/mL）Tab 2 Results of contents determination of samples（n＝3，ng/mL）

3 討論

本試驗曾考察了水-乙腈、0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈作為流動相時的分離情況。結(jié)果，0.1%甲酸-乙腈為流動相時，胸腺素α1的響應(yīng)值更大、靈敏度更高，因此本試驗最終選擇0.1%甲酸-乙腈作為流動相。本試驗還考察了胸腺素α1的工作模式，發(fā)現(xiàn)其在正離子監(jiān)測模式下響應(yīng)值均較好，故最終采用正離子監(jiān)測模式。

綜上所述，本方法簡單快速、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于胸腺肽腸溶片中胸腺素α1含量的測定。

[1] 楊華良.胸腺肽腸溶片治療頑固性復(fù)發(fā)性口瘡的臨床研究[J].中國醫(yī)藥指南，2014，12（1）：125-126.

[2] 張鵬，黃啟來，華子春.胸腺肽α1的研究進(jìn)展[J].東南大學(xué)學(xué)報，2013，32（3）：344-350.

[3] 林蘭，劉建文.胸腺肽制劑及臨床應(yīng)用研究現(xiàn)狀[J].中國藥事，2009，23（7）：706-717.

[4] 李潔，王曉杰，鄒素蘭.胸腺肽的臨床應(yīng)用與研究進(jìn)展[J].中國藥房，2008，19（14）：1108-1109.

[5] Garaci E，Pica F，Rasi G，et al.Thymosin alphal in the tr-eatment of cancer：from basic research to clinical application[J].INT J Immuno Pharmaco，2000，22（12）：1067-1076.

[6] 國家藥品監(jiān)督管理局.國家藥品標(biāo)準(zhǔn)：WS1-（X-001）-2000[S].2002.

[7] 周天瓊，俞保彬.胸腺肽腸溶膠囊含量測定方法學(xué)研究[J].山東化工，2013，42（10）：80-82.

[8] Low TL，Goldstein AL.Thymosins：structure，function and therapeutic applications[J].Thymus，1984，6（1/2）：27-42.

[9] 楊昭鵬，劉海靜，廖海明，等.胸腺肽及制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].藥物分析雜志，2002，22（2）：144-146.

[10] 楊曉暉.胸腺肽及制劑多肽含量測定方法研究[J].黑龍江醫(yī)藥，2003，16（6）：499-501.

Content Determination of Thymosin α1in Thymopolypeptides Enteric-coated Tablets by HPLC-MS/MS

QIU Xinfeng（Dept.of Pharmacy，Anqing Hospital Affiliated to Anhui Medical University，Anhui Anqing 246003，China）

OBJECTIVE：To establish a method for content determination of thymosin α1in Thymopolypeptides enteric-coated tablets.METHODS：HPLC-MS/MS method was adopted.The determination was performed on Luna C1（82）with mobile phase consisted of 0.1%formic acid-acetonitrile（gradient elution）at the flow rate of 0.7 mL/min.The column temperature was set at 30℃，and sample size was 20μL.ESI was used with ion spray voltage of 4.5 kV，sheath gas flow rate of 60 arb，aux gas flow rate of 30 arb，sweep gas flow rate of 10 arb and capillary temperature at 320℃.The working mode was positive ion monitoring mode.RESULTS：The linear range for thymosin α1was 1-1 000 ng/mL（r＝0.999 9）.The limit of quantitation was 1 ng/mL.The limit of detection was 0.1 ng/mL.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%.The recoveries were 95.0%-98.0%（RSD＝1.2%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，rapid，sensitive and accurate，and can be suitable for simultaneous determination of thymosin α1in Thymopolypeptides enteric-coated tablets.

Thymopolypeptides enteric-coated tablet；Thymosin α1；HPLC-MS/MS

R927.2

A

1001-0408（2017）30-4302-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.30.34

＊副主任藥師。研究方向：藥物與臨床。電話：0556-5218788。E-mail：87360008@qq.com

2017-03-25

2017-05-25）

（編輯：劉柳）