水溶性豌豆多糖的提取及性能研究

程 萌 齊軍茹 曹 靜

(華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640)

水溶性豌豆多糖的提取及性能研究

程 萌 齊軍茹 曹 靜

(華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640)

為了提升豌豆加工副產(chǎn)物——豌豆粉渣的高值利用化，以豌豆粉渣為原料，系統(tǒng)研究了不同的提取條件對(duì)水溶性豌豆多糖(Pea soluble polysaccharide, PSPS)得率及功能特性的影響，同時(shí)對(duì)PSPS的分子量，不同pH條件下的Zeta電位和酸性條件下的粒度分布進(jìn)行測(cè)定，以及對(duì)其微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察分析。研究結(jié)果表明,豌豆多糖的最佳提取工藝為：固液比1∶20，中性淀粉酶添加量為0.24%，酶解時(shí)間為 30 min；復(fù)合植物水解酶Viscozyme L添加量0.15%，酶解時(shí)間為30 min，除蛋白時(shí)間為30 min，pH 5.0，120 ℃高壓1.5 h。在此條件下的PSPS得率可達(dá)10.43% 且分散穩(wěn)定性最優(yōu)，其分子質(zhì)量主要分布在252 kDa左右；在pH 3.5～11.0條件下，PSPS的電位絕對(duì)值高于水溶性大豆多糖(Soybean soluble polysaccharide, SSPS)，接近于高酯果膠(High methoxyl pectin, HMP)；在pH 3.6～4.6的環(huán)境中，PSPS粒度分布與SSPS相近。試驗(yàn)表明PSPS是一種類似于SSPS且具有分散穩(wěn)定性的多糖。

豌豆粉渣 水溶性豌豆多糖(PSPS) 提取 分散穩(wěn)定性

豌豆(PisumsativumL．)屬于豆科豌豆屬，是第二大食用豆類作物，已在84個(gè)國(guó)家廣泛種植[1]。我國(guó)豌豆產(chǎn)量占全世界的三分之一，是世界第二大豌豆生產(chǎn)國(guó)[2]。豌豆中除了含有豐富的維生素和十余種人體必需的礦物質(zhì)元素[3]外，其成熟籽粒中的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21%～28%，淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為48%～52%，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～2.7%，粗纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.5%～8.4%[4-5]。基于我國(guó)豐富的豌豆資源，豌豆淀粉及粉絲制品加工已形成很大的市場(chǎng)規(guī)模，用豌豆提取淀粉和蛋白質(zhì)的副產(chǎn)品即為豌豆粉渣(豌豆纖維)，每年都有大量的加工副產(chǎn)物被工廠遺棄或用作動(dòng)物飼料，很少有廠家進(jìn)行豆渣的再回收利用，造成極大的環(huán)境污染與資源浪費(fèi)[6]。然而，這些被廢棄的豆渣中卻含有具有功能特性的水溶性豌豆多糖(Pea soluble polysaccharide, PSPS)，其溶解性好、黏度低且無豆腥味，有望成為一種新型的食品添加劑[7]。隨著人們飲食觀念的改變，對(duì)酸性蛋白飲料的需求也越來越大，穩(wěn)定性好，口感清爽，風(fēng)味獨(dú)特是現(xiàn)代飲料的發(fā)展趨勢(shì)[8]。而酸性蛋白飲料中通常需要加入分散穩(wěn)定劑來防止蛋白質(zhì)在加工儲(chǔ)藏過程中的聚集沉淀[9-10]。水溶性植物多糖用于清爽型含乳蛋白飲料中，目前也被證明是最好的[11]。如今，水溶性大豆多糖(Soybean soluble polysaccharide, SSPS)在益力多、養(yǎng)樂多等飲料中已經(jīng)得到了廣泛地應(yīng)用，這為PSPS日后的市場(chǎng)開發(fā)與推廣提供了良好的借鑒。

目前，Asai等[12]和Nakamura等[13]對(duì)PSPS的提取、組成和應(yīng)用等進(jìn)行了研究。但國(guó)內(nèi)對(duì)PSPS研究還較為罕見，本研究利用豌豆粉渣進(jìn)行PSPS的制備和性能研究，不僅能變廢為寶，減輕環(huán)境污染，還能大大提高我國(guó)豌豆粉渣資源的利用價(jià)值，為PSPS的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

豌豆粉渣：山東健源食品有限公司；水溶性大豆多糖：福建味博食品有限公司；脫脂乳粉(蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33%)：新西蘭恒天然集團(tuán)；高酯果膠：美國(guó) CP Kelco公司；中性淀粉酶BAN 480L(480 KNU/g) 和復(fù)合植物水解酶Viscozyme L(100 FGB/g)：諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；其他生化試劑均為分析純。所有溶液均使用去離子水制備。

1.2 儀器與設(shè)備

YX-280型手提式壓力蒸汽滅菌器：合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；B-290型噴霧干燥機(jī)：瑞士BUCHI 公司；Waters 1525 高效液相色譜儀: 美國(guó)Waters 公司；Mastersizer 2000 粒度分布儀：英國(guó)Malvern公司；MultiMode SPM 型原子力顯微鏡：美國(guó)Veeco 公司。

1.3 方法

1.3.1 PSPS的制備

取40 g 豌豆粉渣，加入去離子水按固液比1∶20充分?jǐn)嚢韬螅?0 ℃水浴1 h，添加中性淀粉酶(pH 6.5,50 ℃)和Viscozyme L(pH 5.0, 50 ℃)，再調(diào)節(jié)溶液至pH 8.0除去殘余蛋白。離心(8 000 r/min，20 min)后的沉淀加入適量去離子水?dāng)嚢瑁{(diào)節(jié)體系至pH 5.0，在120 ℃、0.1 MPa條件下高壓蒸煮1.5 h。冷卻后離心(8 000 r/min，20 min)取其上清液，通過噴霧干燥制得粉末狀的PSPS。

1.3.1.1 中性淀粉酶對(duì)PSPS得率及性能的影響

根據(jù)中性淀粉酶的使用特性，本試驗(yàn)的中性淀粉酶添加量分別選取0、0.06%、0.12%、0.18%、0.24%、0.30%；酶解時(shí)間分別選取0、10、30、60、90 min，其他條件為：Viscozyme L添加0.15%，處理30 min；除蛋白30 min。考察中性淀粉酶的添加量和酶解時(shí)間對(duì)PSPS得率及性能的影響。

1.3.1.2 Viscozyme L對(duì)PSPS得率及性能的影響

設(shè)定Viscozyme L添加量分別為0、0.075%、0.15%、0.225%、0.30%，酶解時(shí)間分別為0、10、30、60、90 min，其他條件為：中性淀粉酶添加0.24%，酶解30 min；除蛋白30 min。考察Viscozyme L添加量和酶解時(shí)間對(duì)PSPS得率及性能的影響。

1.3.1.3 除蛋白時(shí)間對(duì)PSPS得率及性能的影響

豌豆渣中含有一定量殘留蛋白，在堿性的條件下可將這部分蛋白去除。設(shè)定除蛋白時(shí)間分別0、10、30、60、90 min，中性淀粉酶添加0.24%，處理30 min；Viscozyme L添加0.15%，酶解30 min。考察除蛋白時(shí)間對(duì)PSPS得率及性能的影響。

1.3.2 多糖得率計(jì)算

1.3.3 酸性蛋白飲料的制備

通過在酸性蛋白飲料中添加PSPS來評(píng)估其分散穩(wěn)定性。將脫脂乳粉，多糖分別溶解于去離子水中，其中多糖在溶解前和白砂糖混合均勻。攪拌2 h后，將奶液緩慢加入到多糖溶液，混合成蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%，白砂糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%的溶液，用pH 3.0的檸檬酸、檸檬酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)溶液pH為4.0～4.2。

1.3.4 酸性蛋白飲料沉淀率和濁度的測(cè)定

沉淀率：將配制好的酸性蛋白飲料搖勻，取一定量的樣品于離心管中，常溫下4 000 r/min離心20 min，離心后倒出上清液，倒置5 min 后稱重計(jì)算沉淀率。每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，取平均值。

濁度：吸取1 mL 上清，用去離子水稀釋10倍，在550 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定紫外吸光值。每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，取平均值。

1.3.5 PSPS分子質(zhì)量的測(cè)定

采用高效凝膠色譜分析(GPC) 法將已知相對(duì)分子質(zhì)量(Mr) 的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(Mr = 5.2、11.6、23.8、48.6、148、410、668、1 482 kDa)用0.02 mol/L 的用流動(dòng)相配制成2.0 mg/mL 的溶液，進(jìn)樣量20 μL，每個(gè)樣檢測(cè)時(shí)間為40 min，記錄色譜圖，以葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(logMw)對(duì)洗脫體積(V)用Breeze1 GPC 數(shù)據(jù)軟件進(jìn)行回歸處理，得到葡聚糖相對(duì)分子質(zhì)量分布標(biāo)準(zhǔn)曲線及其回歸方程。色譜條件：TSK G-5000 PWXL column(7.8 mm×300 mm)和TSK G-3000 PWXL column(7.8 mm×300 mm)串聯(lián)，流動(dòng)相為0.02 mol/L的KH2PO4緩沖溶液，流速為0.6 mL/min，waters 2414 示差檢測(cè)器，柱溫35 ℃。將自制的PSPS用0.02 mol/L 的用流動(dòng)相配置成2.0 mg/mL 的溶液，在相同的條件下進(jìn)行以上操作。

1.3.6 Zeta電位的測(cè)定

Zeta電位是帶電粒子平滑層產(chǎn)生的電勢(shì)。選擇滴定Zeta電位功能，將測(cè)量區(qū)間設(shè)定為pH值2.0～11.0。通過軟件運(yùn)用相關(guān)數(shù)學(xué)模型測(cè)定Zeta 電位值。用去離子水稀釋樣品至質(zhì)量濃度1 mg/mL，用粒度電位分析儀測(cè)定體系的Zeta 電位，在25 ℃進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3次取平均值。

1.3.7 動(dòng)態(tài)光散射(DLS)粒度測(cè)量

納米粒度分析測(cè)量利用激光散射儀在90°散射角下進(jìn)行，緩沖液調(diào)節(jié)溶液pH為3.6～4.6，溶液稀釋至多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL，于25 ℃下測(cè)量，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3次取平均值。

1.3.8 原子力顯微鏡(AFM)測(cè)量

多糖分子形態(tài)信息通過原子力顯微鏡觀察獲得。將PSPS和SSPS充分溶于去離子水，配制成1 mg/mL溶液，用2 mmol/L的吐溫20稀釋到2 μg/mL。取2 μL樣品溶液分散于新鮮剝離的干凈云母片上，室溫下風(fēng)干后用MultiModeSPM顯微鏡觀察。測(cè)試用輕敲模式成像。操作條件：掃描速度為1.0 Hz；頻率為320 kHz；共振頻率為290 kHz；硅懸臂長(zhǎng)度為125 μm，曲率半徑為42 N/m。使用 Digital Nanoscope 軟件對(duì)AFM 圖片進(jìn)行處理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中性淀粉酶添加量對(duì)PSPS得率及性能的影響

從圖1可以看出，隨著中性淀粉酶量的增加，PSPS的得率提高，PSPS穩(wěn)定蛋白的溶液沉淀率下降，上清液濁度上升。當(dāng)中性淀粉酶添加量到達(dá)0.24%后，沉淀率與上清液濁度均趨于平緩。這是因?yàn)榈矸勖改芩庠现械牡矸郏瑫r(shí)也使豌豆渣結(jié)構(gòu)變蓬松，添加淀粉酶越多，豌豆渣中的淀粉去除越徹底，最終高壓階段得到得率高分散穩(wěn)定性佳的樣品。當(dāng)中性淀粉酶添加量到達(dá)0.24%后，淀粉酶酶解效果接近飽和。為節(jié)約時(shí)間和資源，選取中性淀粉酶添加量為0.24%。

圖1 中性淀粉酶添加量對(duì)PSPS得率及穩(wěn)定酸性乳飲料能力(沉淀率和濁度)的影響

2.2 中性淀粉酶酶解時(shí)間對(duì)PSPS得率及性能的影響

固定中性淀粉酶添加量0.24%，由圖2可得，隨著淀粉酶酶解時(shí)間的增加，PSPS得率提高，其穩(wěn)定蛋白的溶液沉淀率降低，上清液濁度增大。當(dāng)?shù)矸勖该附鈺r(shí)間到達(dá)30 min后，其得率上升緩慢，且沉淀率和上清液濁度均趨于不變。這是因?yàn)榈矸勖笇?duì)原料的酶解時(shí)間越長(zhǎng)，去除淀粉更充分，同時(shí)有利于原料結(jié)構(gòu)的展開，最終得到量多、分散穩(wěn)定性佳的樣品。但當(dāng)酶解到達(dá)30 min以后，淀粉酶酶解效果接近飽和，所以選取中性淀粉酶酶解時(shí)長(zhǎng)為30 min。

圖2 中性淀粉酶酶解時(shí)間對(duì)PSPS得率及穩(wěn)定酸性乳飲料能力(沉淀率和濁度)的影響

2.3 Viscozyme L添加量對(duì)PSPS得率及性能的影響

為了研究Viscozyme L添加量對(duì)豌豆多糖得率的影響，固定Viscozyme L酶解時(shí)間為30 min，從圖3可以看出，隨著Viscozyme L量的增加，PSPS的得率呈明顯上升趨勢(shì)，其穩(wěn)定的蛋白溶液隨著Viscozyme L添加量的增加沉淀率則先下降后上升，而上清液濁度先上升后下降。

添加Viscozyme L對(duì)PSPS的制備具有重要作用。一開始對(duì)原料中纖維進(jìn)行有效的分解，使內(nèi)部結(jié)構(gòu)部分?jǐn)嗔眩欣诤罄m(xù)的高壓處理中PSPS的壓出；但Viscozyme L添加過量時(shí)，原料中纖維被水解過度，在后續(xù)高壓處理后得到的PSPS中含有較多的不具有分散穩(wěn)定性的小分子糖。當(dāng)Viscozyme L添加量為0.15%分散穩(wěn)定性最優(yōu)。

圖3 Viscozyme L 添加量對(duì)PSPS得率及穩(wěn)定酸性乳飲料能力(沉淀率和濁度)的影響

2.4 Viscozyme L酶解時(shí)間對(duì)PSPS得率及性能的影響

由圖4可見，隨著Viscozyme L添加量的增加，PSPS在30 min處有最高得率，其穩(wěn)定的蛋白溶液沉淀率先下降后上升，上清液濁度先上升后下降。這是因?yàn)楫?dāng)Viscozyme L反應(yīng)時(shí)間較短時(shí)，原料中的纖維素水解不充分，其結(jié)構(gòu)仍較緊密，故高壓階段多糖很難溶出，最終得率較低。隨著Viscozyme L反應(yīng)時(shí)間增加，Viscozyme L充分水解，在酶解時(shí)間到達(dá)30 min時(shí)，原料被酶解的程度最佳，故高壓后得到得率最高的多糖。但隨著Viscozyme L酶解時(shí)間過長(zhǎng)，原料中的纖維被過度處理，在后續(xù)高壓處理后得到的PSPS中含有較多的不具有分散穩(wěn)定性的小分子糖。 Viscozyme L酶解最優(yōu)時(shí)長(zhǎng)為30 min。

圖4 Viscozyme L酶解時(shí)間對(duì)PSPS得率及穩(wěn)定酸性乳飲料能力(沉淀率和濁度)的影響

2.5 除蛋白對(duì)PSPS得率及性能的影響

采用杜馬斯燃燒法測(cè)定豌豆粉渣中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(14.45±0.11)%。從圖5可以看出，隨著除蛋白作用時(shí)間的增加，PSPS的得率呈明顯下降趨勢(shì)，當(dāng)除蛋白時(shí)間超過30 min，得率下降趨勢(shì)趨于平緩。與此同時(shí)，PSPS穩(wěn)定蛋白的溶液沉淀率呈先下降后上升趨勢(shì)，上清液濁度呈先上升后下降趨勢(shì)。

這是因?yàn)殡S著除蛋白時(shí)間的增加，原料中的可溶性蛋白被去除，造成最終得到的PSPS得率降低，但分散穩(wěn)定性得到有效的提高。作用時(shí)間達(dá)30 min以后，可能因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的蒸煮導(dǎo)致原料中有部分PSPS損失,導(dǎo)致其穩(wěn)定性能減弱。除蛋白時(shí)間為30 min時(shí)能兼顧PSPS得率與性能。

圖5 除蛋白時(shí)間對(duì)PSPS得率及穩(wěn)定酸性乳飲料能力(沉淀率和濁度)的影響

2.6 PSPS分子質(zhì)量分析

由圖6可以看出，PSPS分子質(zhì)量最大峰的峰值為252 269左右，此峰占了分子質(zhì)量分布的66.81%，此外，PSPS具有一個(gè)獨(dú)特的10 718的峰，占峰面積12.65%。此小分子質(zhì)量峰出現(xiàn)與提取工藝有關(guān)，因PSPS未經(jīng)乙醇純化，所以存在小分子糖。綜合Akihiro等[14]SSPS的研究表明，發(fā)現(xiàn)PSPS與SSPS的分子質(zhì)量分布較為相似。由此認(rèn)為，自制的PSPS的分散穩(wěn)定性在分子質(zhì)量層面上可能接近于SSPS的分散穩(wěn)定性。

圖6 PSPS分子量分布

2.7 Zeta電位分析

由圖7可看出，在pH 2.0～11.0的條件下，高酯果膠(HMP)，SSPS始終帶負(fù)電荷，說明二者皆屬于陰離子多糖，這與前人結(jié)果一致[15-16]。隨著 pH值的上升，PSPS電位絕對(duì)值的不斷增大。并且，在pH到達(dá)3.5以后，PSPS 的電位絕對(duì)值逐漸高于SSPS的電位值并且接近HMP的電位值，證明其所帶負(fù)電荷高于SSPS而接近HMP。因此，從電位層面上分析， PSPS 是一種陰離子多糖，其穩(wěn)定蛋白的能力一定程度上優(yōu)于SSPS而與接近于HMP。

圖7 HMP、SSPS、PSPS溶液的Zeta電位值

2.8 粒徑分析

通過對(duì)PSPS和SSPS在pH 3.6～4.6之間粒徑分布的分析，從圖8可以看出，與HMP比，PSPS和SSPS的主峰更為接近，均主要分布在20～30 nm左右。當(dāng)體系pH為4.0～4.6時(shí)，SSPS相較PSPS而言，主峰量下降，且在粒徑 500 nm附近分布更明顯。PSPS的粒徑則從pH3.6～4.6均沒有顯著的變化，非常穩(wěn)定，可以預(yù)測(cè)PSPS的分散穩(wěn)定能力應(yīng)該比SSPS更優(yōu)越。

圖8 HMP，SSPS和PSPS溶液在不同pH值條件下的粒徑分布

2.9 形貌學(xué)分析

AFM常用來對(duì)多糖分子的尺寸、表面形貌進(jìn)行觀測(cè)，研究各多糖的性質(zhì)[17]。根據(jù)lkeda等[18]的方法，通過吐溫-20作為稀釋劑從而增大多糖側(cè)鏈的展開,將樣品分散開的云母片置于原子力顯微鏡下觀察，結(jié)果見圖9。可以看出，HMP 微觀結(jié)構(gòu)是類似于直線型的聚合物，SSPS和PSPS為星狀的多支鏈的聚合物。同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)SSPS和PSPS的粒徑大小相近，主要分布在20～30 nm左右，而HMP的粒徑較大。充分表明PSPS是在微觀結(jié)構(gòu)和粒徑大小都與SSPS極其相似的一類多糖。由此可以推測(cè)，PSPS會(huì)具有與SSPS相似的功能特性。

圖9 HMP、SSPS和PSPS溶液原子力電鏡圖

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)確定酶輔助酸法提取PSPS的最優(yōu)工藝為：固液比1∶20、中性淀粉酶添加量為0.24%，酶解時(shí)間為30 min；Viscozyme L添加量為0.15%，酶解時(shí)間為30 min；除蛋白時(shí)間為30 min，pH 5.0、120 ℃高壓1.5 h。在此工藝下得到的PSPS得率可達(dá)10.43%且分散穩(wěn)定性佳。并通過Zeta電位及納米粒度分析儀，原子力顯微鏡等分析手段證明PSPS在分子質(zhì)量分布、Zeta 電位、粒度分布以及微觀結(jié)構(gòu)上都與SSPS極為相似。本研究大大提升了豌豆副產(chǎn)物的開發(fā)和利用，也為PSPS作為一種新型的食品添加劑在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供了參考。

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Extraction and Characterization of Pea Soluble Polysaccharide

Cheng Meng Qi Junru Cao Jing

(College of Food Sciences and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640)

Pea residue, a by-product of pea processing, was investigated as a source of pea soluble polysaccharide (PSPS) to make the most of waste. The extraction factors which affect the yield and dispersion stability of PSPS were researched through single-factor experiments. The molecular weight, Zeta potential at different pH and the size distribution at acid condition of PSPS were determined, respectively. Meanwhile the molecular microstructure of PSPS was examined. The optimum technological conditions were shown as following: the ratio of material to liquid 1∶20, 0.24% of amylase additive amount with reaction time 30 min, 0.15% of Viscozyme L additive amount with reaction time 30 min, deproteinization time 30 min and heating at 120°C at pH 5.0 for 1.5 h. Under the above conditions, the yield of PSPS was 10.43% with great dispersion stability. The molecular weight of PSPS was distributed around 252 kDa. The absolute negative charges of PSPS from pH 3.5 to 11.0 were higher than those of soybean soluble polysaccharide (SSPS) and closed to high methoxyl pectin (HMP). The particle size distribution of PSPS was similar to SSPS at pH range from 3.6 to 4.6. It turned out that PSPS was polysaccharide with great dispersion stability like SSPS.

pea residue, pea soluble polysaccharide (PSPS), extracting, dispersion stability

TS 201.1

A

1003-0174(2017)10-0054-07

國(guó)家自然科學(xué)基金青年-面上連續(xù)資助項(xiàng)目(31370036)，中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(2015ZZ119)

2016-08-12

程萌，女，1993年出生，碩士，蛋白物性修飾及功能性多糖

齊軍茹，女，1977年出生，教授，蛋白物性修飾及功能性多糖