一株近平滑假絲酵母的分離、鑒定和產油的研究

謝鑫磊 林源鋒 魯 昊 田 華 袁 博 鄭 操 陳 濤 何東平

(武漢輕工大學食品科學與工程學院1，武漢 430023)(湖北天基生物能源發展有限公司2，漢川 432300)(中國科學院武漢病毒研究所3，武漢 430071)

一株近平滑假絲酵母的分離、鑒定和產油的研究

謝鑫磊1林源鋒1魯 昊2田 華1袁 博1鄭 操1陳 濤3何東平1

(武漢輕工大學食品科學與工程學院1，武漢 430023)(湖北天基生物能源發展有限公司2，漢川 432300)(中國科學院武漢病毒研究所3，武漢 430071)

為了制備生物柴油而獲得高產油脂的酵母，分離出1株產油酵母，利用分子生物學技術對其RNA基因內轉錄區(ITS區)進行了克隆測序，并與GenBank中已有的菌株基因序列進行比對；同時，對該菌株生長發育和油脂合成進行了研究；對生物量、糖氮代謝、油脂含量以及脂肪酸組分進行了檢測分析。結果表明：該菌株ITS序列長度為479 bp，與GenBank中近平滑假絲酵母相比較同源率接近100%，形態結果和分子生物學鑒定表明該菌株為近平滑假絲酵母；該菌在0～12 h期間菌體數量穩定增長，糖氮消耗明顯為近平滑假絲酵母的發酵適應期；12～48 h，此時菌種快速繁殖，糖氮消耗非常顯著，為近平滑假絲酵母的對數期；48～120 h，菌體數量保持穩定基本不再增長，糖氮消耗穩定為近平滑假絲酵母的穩定期；120 h以后，菌體數量減少，糖氮基本消耗完畢為近平滑假絲酵母的衰退期；在120 h左右胞內油脂積累達到最大值，油脂產量為4.5 g/L，含油率約為22%，脂肪酸組成主要以油酸為主，并含有少量棕櫚酸和亞油酸。因此，該菌作為油脂菌株生產生物柴油具有一定前景,為以后調整培養基含量來增加菌種油脂產量提供了參考。

近平滑假絲酵母 分離鑒定 產油

微生物油脂又稱單細胞油脂，是由酵母、霉菌、細菌和藻類等微生物在一定條件下利用碳水化合物和普通油脂作為碳源在菌體內產生的大量油脂[1]。利用微生物生產油脂，與傳統的油脂生產工藝相比，除具有油脂含量高外，還有許多優點。微生物細胞增殖快，生產周期短；微生物生長所需的原料豐富，價格便宜，如淀粉、糖類、甚至食品工業和造紙行業的廢棄物，從而保護了環境；用微生物方法生產油脂，比農業生產油脂所需的勞動力少，同時不受季節、氣候變化的限制；能連續大規模生產，生產成本低；并且可以利用細胞融合、細胞誘變等高科技方法，使微生物生產出比動、植物油脂更符合人們需要的高營養油脂或某些特定脂肪酸的油脂[2]。

近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)，屬假絲酵母屬[3]，可產生多種代謝產物，如還原型谷胱甘肽[3]、氧化還原酶[4]及木糖還原酶[5]等，是具有催化能力的菌株[6-7]，也可作為發酵劑用于肉制品發酵[8]，因此具有較好的發展前景。目前，國內外對于近平滑假絲酵母的研究多集中于醫學方面，主要是對假絲酵母感染人體造成婦科病的研究，以及對還原酶等生物催化劑方面的研究，而對于其生物量以及是否產油則研究較少。本試驗通過篩選產油菌株得到1株酵母，利用分子生物學技術對其進行菌種鑒定，并對培養條件、形態學特征、生物量和產油進行了研究。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株與試劑

近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)分離于實驗室其他產油菌株，保存于本實驗室，菌號為20164071。

葡萄糖：天津博迪化工股份有限公司；酵母膏：北京奧博星生物技術有限責任公司；蛋白胨：天津市大茂化學試劑廠；酵母提取物、色譜級正己烷、鹽酸、石油醚、乙醚：天津市科密歐化學試劑制造有限公司；50%三氟化硼-甲醇：山東西亞化學工業有限公司；無水乙醇：天津天力化學試劑有限公司；TSP101基因組抽提試劑盒：北京擎科新業生物技術有限公司。

1.1.2 培養基

固體篩選培養基(g/L)：蛋白胨5,葡萄糖10，酵母膏3，麥芽提取物3，瓊脂20，pH 6.5。種子培養基(g/L)：蛋白胨5，葡萄糖10，酵母膏3，麥芽提取物3,pH 6.5。發酵培養基在種子培養基的基礎上加大了各成分的用量。

1.1.3 儀器

Agilent SP-2560氣相色譜儀：安捷倫科技(中國)有限公司；SPX-150C恒溫恒濕箱、GZX-9070MBE電熱鼓風干燥箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；HYQ-150S全溫搖床：武漢匯誠生物科技有限公司，YM75立式壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫療器械有限公司；XSP-BM-2CA光學生物顯微鏡：寧波永新光學有限公司；RE-52C 旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；TDZ5-WS臺式低速離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 產油菌株的篩選

將長勢良好的斜面菌種挑取1環，接種于固體篩選培養基中，培養條件27 ℃。然后經多次轉接活化之后挑選生長良好的單菌落接種于種子培養基中，培養條件27 ℃，180 r/min，培養48 h，然后以10%的接種量接種于裝有100mL發酵培養基的500 mL三角瓶中，培養條件27 ℃，180 r/min，培養96 h。

1.2.2 菌株鑒定方法

1.2.1.1 基因組提取

將菌株挑取到無菌的超純水中，用移液器充分混勻，高溫加熱到90 ℃，釋放基因組。然后通過基因組抽提試劑盒，抽提得到該菌的基因組DNA。

1.2.1.2 ITS區擴增

將擴增好的基因組樣品通過特異性的鑒定引物，擴增出目的片段。體系為：TSINGKE 金牌MIX 46μL，ITS1 1 μL，ITS4 1 μL，基因組2 μL。擴增出片段大小為 500～700 bp的ITS區產物。

1.2.1.3 PCR產物純化及測序

將PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶。然后通過(GE0101)DNA凝膠回收試劑盒回收。然后將純化后的產物通過ABI的測序mix，PCR純化產物以及ITS引物，進行測序PCR擴增。將擴增后的產物通過ABI3730xl測序儀進行檢測，并將檢測結果整理后發送。

1.2.3 發酵過程中糖氮代謝的測定

1.2.3.1 含糖量的測定

蒽酮-硫酸法測定總糖

制定標準曲線：分別取2 mg/mL葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，用蒸餾水補到2.0 mL，空白管吸取2 mL蒸餾水。分別加入8.0mL蒽酮試劑，迅速浸入冰水浴中冷卻，各管加完后一起浸入沸水浴中10分鐘，封口防政法，取出用自來水冷卻，室溫放置10 min，于620 nm處比色。以吸光度為縱坐標，糖含量為橫坐標，得標準曲線。

樣品含量測定：取樣品溶液2.0 mL，加入8 mL蒽酮試劑，同標準曲線制作，比色測定記錄吸光度，根據標準曲線計算糖含量。對不同時間培養液從0 h起依次進行測定，記錄數據，繪制培養液的糖代謝曲線[10]。

1.2.3.2 含氮量的測定

每隔12 h從搖瓶中取適量發酵液，用四層紗布過濾后取2 mL加入到裝有10 mL蒸餾水的燒杯中，再加入1滴甲基紅。用0.3 mol/L的硫酸調制紅色，然后以0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調制橙黃色，再加入4 mL18%中性甲醛。靜置10分鐘后加入8滴酚酞，用0.1 mol/L氫氧化鈉滴定至微紅后記錄氫氧化鈉使用量[11]。發酵液中氮含量的計算公式：

N= (0.1×V×0.014)/2×100

式中：N為氮含量；V為氫氧化鈉消耗的體積。

1.2.4 發酵過程中pH值測定

從菌株加入發酵瓶開始計時，每隔12 h取少量發酵液用pH計測其pH值。

1.2.5 生物量測定

近平滑假絲酵母的生物量以細胞干重計。取培養好的菌體發酵液100 mL于預先稱重好的離心管中以4 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀的菌泥用鑰匙刮出置于18 cm大平皿中，然后再往離心管中加入適量蒸餾水繼續離心一次，取出剩余菌泥。將菌泥置于烘箱中于60 ℃下烘干至質量恒定，稱質量。生物量(g/L)的計算公式為：

1.2.6 油脂的提取及產量的測定

油脂的提取：將近平滑假絲酵母發酵液經過離心后，去除上清液，向所得藻泥中加入100 mL 6 mol/L鹽酸，震蕩混勻，室溫放置1 h后沸水浴加熱8 min后置于-20 ℃迅速冷卻30 min，倒入分液漏斗中，加入150 mL無水乙醇震蕩再加150 mL乙醚與150 mL石油醚萃取，收集有機層于已稱重的試管中，記錄空試管質量為m1；加熱使有機溶劑揮發，稱重，記錄此時試管質量為m2，油脂產量(g/L)和含油率計算公式為：

1.2.7 油脂成分的分析

1.2.7.1 待測樣品的處理: 精密稱取0.2 g油脂于20 mL試管中，加入0.5 mol/L的NAOH-CH3OH溶液2 mL，邊振蕩邊在60 ℃水浴中保溫30 min，冷卻后加入50%的BF3-CH3OH溶液2 mL，邊振蕩邊在60 ℃水浴下保溫3 min,加入2 mL正己烷，混勻，以2 000 r/min離心1 min，取上清液。然后用進樣針經過濾膜過濾之后注射進進樣瓶中待測。

1.2.7.2 油脂脂肪酸組成分析：選用Agilent SP-2560色譜柱(100 m×25 μm，0.2 μm)；升溫程序：初始溫度100 ℃，保持4 min，然后以3 ℃/min升溫至230 ℃，保持20 min，載氣(N2)流速25 mL/min，壓力2.4 kPa，進樣量1 μL；分流比30∶1

2 結果與分析

2.1 菌種篩選和鑒定

菌株產生的單菌落呈圓狀黏稠白色如圖1所示。顯微鏡下單細胞個體呈圓形或橢圓形，未見芽殖及假絲菌，如圖2所示。

近平滑假絲酵母ITS區序列檢測結果：

CTTCCGTTAGCACTTACTGCATTTTTTCTTACA-CATGTGTTTTTCTTTTTTTGAAAACTTTGCTTTGGTA-GGCCTTCTATATGGGGCCTGCCAGAGATTAAACTC-AACCAAATTTTATTTAATGTCAACCGATTATTTAAT-AGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCG-CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAA-TATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCGAATCTTT-GAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCA-TGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCCCTCAAACCCTCGG-GTTTGGTGTTGAGCGATACGCTGGGTTTGCTTGAAA-GAAAGGCGGAGTATAAACTAATGGATAGGTTTTTTC-CACTCATTGGTACAAACTCCAAAACTTCTTCCAAAT-TCGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACT-AAGCATATCAAAAA

測序結果表明所測菌ITS區序列長度為479 bp，經比對，該菌ITS區序列與GenBank中登錄的已知菌株Candida parapsilosis H142B(KP674827.1)，Candida parapsilosis n63b(KP675664.1)，Candida parapsilosis M180A(KP675355.1)，Candida parapsilosis M83A(KP675285.1)，Candida parapsilosis H275B(KP674969.1)，Candida parapsilosis H267C(KP674958.1)，Candida parapsilosis H230B(KP674908.1)同源率均為100%。依據形態學并結合18sRNA序列比對結果，鑒定該菌為近平滑假絲酵母。

圖1 菌落形態

圖2 菌株顯微形態

2.2 近平滑假絲酵母的生長曲線

從圖3中可見，0～12 h過程中，圖中曲線平滑前進，菌體數量穩定增長，可以確定為近平滑假絲酵母的發酵適應期；12～48 h過程中，曲線快速上升，此時菌種快速繁殖，可以確定此期間為近平滑假絲酵母的對數期；48～120 h過程中，菌體數量保持穩定基本不再增長，此期間為近平滑假絲酵母的穩定期；120 h以后，發現曲線有下降趨勢，菌體數量減少，說明此期間為近平滑假絲酵母的衰退期。

圖3 近平滑假絲酵母生長曲線圖

2.3 糖氮代謝及pH值的變化

從圖4可以看出，發酵液的pH值是逐漸下降的，說明近平滑假絲酵母在發酵過程中是產酸的，并且在24～84 h這一過程中pH值迅速下降之后趨于平穩，說明這一時間段內近平滑假絲酵母大量產酸，之后在摸索調配最佳培養基時我們可以在這一時間段內調節發酵液的pH值使其穩定在中性。從圖5和圖6可以看出，在生長期以及對數期，培養基中糖和氮的消耗都非常明顯，基本都是到了84 h時全部消耗殆盡了。油脂的產生需要糖來轉化，而含氮量也影響著微生物的生長，因此在后續優化培養基的過程中我們可以使適當提高含糖量以及含氮量，或者在菌種糖氮消耗完時適當補充一定的碳源和氮源，以期使得菌種個體生長的更大能產生更多的油出來。

圖4 不同時期發酵液pH值

圖5 不同時期發酵液糖濃度

圖6 不同時期發酵液氮濃度

2.4 油脂產量和得油率

通過圖7和圖8可以看出近平滑假絲酵母發酵120 h的時候油脂產量達到最大,而得油率也在此時達到最高。發酵120 h之后油脂產量和得油率都開始小幅度下降。所以近平滑假絲酵母最佳的發酵時間約為120 h。

圖7 不同時期油脂產量

圖8 不同時期得油率

2.5 近平滑假絲酵母胞內油脂脂肪酸組分測定

通過圖9和表1，可以得到近平滑假絲酵母胞內油脂成分的組成結果。從結果發現脂肪酸組成與橄欖油的脂肪酸組成相似。成分組成以油酸為主，并含有少量的棕櫚酸和亞油酸。

圖9 近平滑假絲酵母胞內油脂脂肪酸氣相-質譜聯用(GC-MS)總離子流圖

脂肪酸種類脂肪酸相對質量分數/%C16∶013．7C18∶173．2C18∶213．1

4 結論

經培養基培養分離、篩選的菌株，利用菌體形態、菌落特征以及通過分子生物學進行ITS區檢測得出菌株為近平滑假絲酵母。對近平滑假絲酵母的生物量、糖氮代謝、pH值、油脂含量以及脂肪酸組成進行了分析，得出在120 h左右胞內油脂積累達到最大值，油脂產量為4.5 g/L,含油率約為22%。確定近平滑假絲酵母所產油脂的脂肪酸組成與橄欖油相似。該菌作為油脂菌株生產生物柴油具有一定前景，本研究為后續繼續研究近平滑假絲酵母，調整發酵培養基成分以增加油脂產量提供了借鑒。

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Seperation, Identification and Oil Production of aCandidaParapsilosisStrain

Xie Xinlei1Lin Yuanfeng1Lu Hao2Tian Hua1Yuan Bo1Zheng Cao1Chen Tao3He Dongping1

(College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University1, Wuhan 430023) (Hubei Tianji New Energy Limited by Share LTD2, Hanchuan 432300) (Wuhan Institute of Virus, Chinese Academy of Sciences3, Wuhan 430071)

In order to gain the yeast with high oil yield for preparing biodiesel and isolating one yeast strain, cloning and sequencing of its internal transcribed region (ITS region) of RNA gene was performed by molecular biology technique. Also it is compared with the existing gene sequences in GenBank. At the same time, the growth and development of this strain were studied. The biomass, carbohydrate and nitrogen metabolism, lipid content and fatty acid composition were also test and analyzed in our study. Results showed that firstly the strain ITS sequence length was 479 bp, compared with theCandidaparapsilosisin GenBank, the homology rate was close to 100%. Results of morphological and molecular biology identification showed that the strain wasCandidaparapsilosis. Secondly the number of bacteria increased steadily during 0～12 h. Sugar and nitrogen consumed obviously. It is the adaptation period ofCandidaparapsilosis; during 12～48 h the bacterias propagated rapidly. Sugar and nitrogen consumption were very significant. It is the Logarithmic phase ofCandidaparapsilosis; during 48～120 h, the number of bacteria remained stable and no longer increased. Sugar and nitrogen consumed stably. It is the stable phase ofCandidaparapsilosis; after 120 h, the number of bacteria decreased. Sugar and nitrogen were all consumed. It is the recession period ofCandidaparapsilosis; thirdly the accumulation value of intracellular oil reached the maximum at 120 h. Oil yield was 4.5 g/L, and the oil content was about 22%, the fatty acid composition was mainly oleic acid, and contained a small amount of palmitic acid and linoleic acid. It can be seen from the results that there are some prospects of this yeast for the production of bio diesel oil. This paper lays a foundation for adjusting the content of medium to increase the oil yield.

candidaparapsilosis,separation and identification,oil production

Q939

A

1003-0174(2017)10-0100-06

2017-04-27

謝鑫磊，男，1993年出生，碩士，微生物油脂

何東平，男，1957年出生，教授，糧食、油脂及植物蛋白