嗜卷書虱羧酸酯酶CarE基因克隆及表達分析

唐培安 李非凡 王進軍 沈 飛 宋 偉

(南京財經大學食品科學與工程學院；江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心1，南京 210023)(西南大學；重慶市昆蟲學及害蟲控制工程重點實驗室2，重慶 400716)

嗜卷書虱羧酸酯酶CarE基因克隆及表達分析

唐培安1李非凡1王進軍2沈 飛1宋 偉1

(南京財經大學食品科學與工程學院；江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心1，南京 210023)(西南大學；重慶市昆蟲學及害蟲控制工程重點實驗室2，重慶 400716)

為探明羧酸酯酶CarE在嗜卷書虱抗藥性中的作用，本研究采用RT-PCR和RACE方法，從嗜卷書虱體內克隆獲得了2條CarE基因全長序列，命名為Lbest1與Lbest2(GenBank登錄號分別為EU854151與EU854152)，2條基因全長為2 049和2 525 bp，編碼570和617個氨基酸組成的蛋白質，理論等電點分別為6.85和4.74。2條基因均具有昆蟲羧酸酯酶的催化活性位點和保守序列，并具有多個磷酸化位點。聚類分析結果表明，2條CarE基因均屬于羧酸酯酶的F簇。定量分析結果表明，Lbest2在敵敵畏和磷化氫抗性品系中的表達水平均顯著高于敏感品系(P<0.05)，而Lbest1在不同品系中的表達水平沒有顯著差異；敵敵畏和磷化氫處理均可誘導2條基因表達水平的提高；Lbest1在發育過程中表達水平逐漸降低，而Lbest2在若蟲期表達水平維持不變。結果表明，Lbest1主要參與調節昆蟲的生長發育，Lbest2具有降解外源性物質和代謝解毒的功能。

嗜卷書虱 羧酸酯酶 抗性機理 基因克隆

羧酸酯酶(CarE)屬于絲氨酸水解酶家族，廣泛存在于生物體的組織與器官內，其活性中心含一個Ser殘基，能有效催化含羧基酯鍵、酰胺鍵和硫酯鍵的內源性與外源性多種化合物的水解[1]。在昆蟲體內CarE是最重要的解毒酶之一，它能與有機磷酸酯、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯類殺蟲劑產生特異性親和，使殺蟲藥劑降解，從而保護昆蟲免受殺蟲藥劑毒害[2-4]。大量研究表明，CarE解毒代謝活性的增強是昆蟲對殺蟲劑產生抗性的重要機理之一[5-8]。棉鈴蟲對有機磷殺蟲劑的抗性以及玉米象對β-細辛醚的抗性均與CarE解毒代謝活性的增強直接關聯[9-10]。進一步研究CarE與昆蟲抗藥性的關系發現，許多昆蟲，如飛蝗L.migratoria、稻縱卷葉螟C.medinalis以及大豆蚜A.glycines等，其對有機磷殺蟲劑產生抗性是由于CarE基因的過量表達導致其活性增強所致[11-13]。

嗜卷書虱(Liposcelisbostrychophila)隸屬于嚙目(Psocoptera)、書虱科(Liposcelididae)，是一種重要的儲藏物害蟲，我國大部分地區都有嗜卷書虱的分布，近年來隨著儲糧熏蒸劑和保護劑的大量應用，嗜卷書虱抗性問題日益突出，而關于嗜卷書虱抗性機理的研究大部分都集中在乙酰膽堿酯酶(AChE)、多功能氧化酶(MFO)和谷胱甘肽S-轉移酶(GST)等方面，關于CarE分子特性及其在抗性形成中的作用報道較少。據此，本試驗通過RT-PCR和RACE技術克隆了嗜卷書虱體內2條CarE基因的全長序列，進而應用實時熒光定量PCR研究其在不同品系、不同發育階段以及藥劑誘導前后基因的表達水平，旨在為揭示CarE在嗜卷書虱抗性形成過程中的作用，制定抗性治理策略提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試書虱

嗜卷書虱敏感品系(Susceptible strain，SS)：源于1990年建立的嗜卷書虱種群，該種群采自西南大學昆蟲學及害蟲控制工程重點實驗室(原西南農業大學應用昆蟲與螨類生態研究室)模擬糧倉中。飼養方法如下：在實驗室(27±1) ℃、(75 ± 5)% RH、不予光照、不接受任何藥劑的條件下以全麥粉、酵母粉和脫脂奶粉(10∶1∶1)混合而成的飼料飼養，該品系也被用于基因克隆試驗。

敵敵畏抗性品系(DDVP-R)：飼養方法相同，每一個月間隔用適當濃度的敵敵畏丙酮溶液熏蒸處理一次，保持成蟲的死亡率在75%左右，所獲得的品系抗性倍數達22.36，作為敵敵畏抗性品系。

磷化氫抗性品系(PH3-R)：飼養方法相同，每一個月間隔用一定量的PH3氣體熏蒸處理一次，保持成蟲的死亡率在75%左右，所獲得的品系抗性倍數達4.51，作為磷化氫的抗性品系。

1.1.2 主要試劑

DEPC：Amersco公司；DNA凝膠回收試劑盒：上海華舜公司；TRIzol Isolation Reagent：Invitrogen公司；M-MLV反轉錄酶、載體pMD 18-T Vector、DH5α感受態細胞competent cell、3’-Full RACE 試劑盒：TaKaRa公司；5’-Full RACE試劑盒：Clontech和Invitrogen公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取

稱取20 mg嗜卷書虱羽化后3～5 d的雌成蟲(約1 000頭)，放于滅菌的研缽中，液氮速凍后迅速研碎，后續步驟參照TRIzol Isolation Reagent試劑盒說明書進行。使用SmartSpecTM 3000核酸濃度分析儀(美國BIO-RAD公司)檢測RNA純度與濃度提取的RNA樣品置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 第一鏈cDNA的合成及PCR擴增

合成第一鏈cDNA的反應體系分別參照3’-Full RACE 試劑盒(TaKaRa)與5’-Full RACE試劑盒(Clontech)的說明書進行。利用簡并引物進行PCR擴增，反應條件：94 ℃預變性3 min，然后94 ℃變性30 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共25個循環，在72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；第二輪半套式PCR反應，將第一輪的PCR產物作為模板，退火溫度為53 ℃，擴增30個循環，其他與第一輪相同。使用特異性引物擴增3’或5’端時，退火溫度參照試劑盒的要求以及基因特異性引物的退火溫度設定，擴增循環數參照試劑盒說明，其他條件相同。PCR擴增產物以1.5%的瓊脂糖膠進行電泳檢測。

1.2.3 PCR產物克隆與測序

經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用DNA凝膠回收試劑盒對目的電泳條帶進行純化，純化產物用pGEM?-T Easy vector連接，轉化到感受態大腸桿菌(E.coliDH5α)。挑選陽性克隆經菌液檢測后送Invitrogen公司測序。

1.2.4 基因表達模式研究

采用實時熒光定量PCR(quantitative real time PCR)方法，測定嗜卷書虱不同品系(SS、DDVP-R、PH3-R)、不同發育時期(1齡、2齡、3齡、4齡若蟲和成蟲)和藥劑誘導前后2條CarE基因mRNA表達水平。

不同品系：包括敏感品系(SS)、敵敵畏抗性品系(DDVP-R)和磷化氫抗性品系(PH3-R)等3個品系，RNA提取等方法相同，每處理設3個重復。

不同發育時期：參考Wang等[14]的方法挑取嗜卷書虱敏感品系1齡、2齡、3齡、4齡若蟲和成蟲進行RNA提取。

藥劑誘導：挑取嗜卷書虱敏感品系雌成蟲30 mg，放入直徑2 cm的塑料小盒中，用160目尼龍絲網作盒蓋，將裝有書虱的小盒放入廣口瓶中，加入5 mg/L的敵敵畏丙酮溶液4 μL或磷化氫氣體6 μL，并設無藥劑處理的對照，密閉后放置在(27±1) ℃、全黑暗條件下熏蒸處理18 h(死亡率在30%左右)；挑取熏蒸后仍存活的書虱20 mg提取總RNA。

實時熒光定量PCR(quantitative real time PCR)方法：使用β-actin作為內參基因，20 μL Real time PCR反應體系中包括：2× MasterMix 10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、cDNA 模板2 μL以及ddH2O 6 μL。循環條件為：95 ℃預變性10 min；隨后進行40個95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s的循環，每個循環退火結束后進行熒光信號采集。循環結束后以0.5 ℃/10 s的速度從60 ℃緩慢遞增到95 ℃，連續測定樣品的熒光強度以獲取熔解曲線，以確定無引物二聚體或非特異性擴增發生。每個樣品至少重復3次。

1.2.5 生物信息學分析

多重序列比對和氨基酸序列的推導使用DNAMAN軟件完成；BLAST搜索、開放閱讀框(ORF)的查找以及酶的催化三聯體的預測在美國國家生物技術信息中心(NCBI) 站點完成；采用 ExPASy 在線軟件預測酶的分子質量(MM)和等電點(pI)；使用Mega 5.1 軟件針對氨基酸序列進行Neighbor-Joining聚類分析，信號肽的預測使用在線軟件SignalP 3.0完成(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)。使用NetNGlyc1.0 Server 軟件對編碼蛋白糖基化位點(N-glycosylation site)進行預測；Scanprosite(http://www.expasy.org/prosite/)用于預測氨基酸序列的磷酸化位點等。

1.2.6 引物設計與數據分析

使用Primer Premier5.0軟件設計克隆試驗所用引物；使用在線引物設計軟件Primer 3.0 (http://frodo.wi.mit.edu/)設計用于實時熒光定量PCR的引物，引物序列與擴增效率見表1；進行實時熒光定量PCR并獲得相應Ct值后，采用2-ΔΔCt法比較目的基因在各個檢測試驗中表達水平的差異；采用SPSS13.0軟件中ANOVA單因素分析方法對數據進行差異顯著性分析(P<0.05)。

表1 引物序列與擴增效率

2 結果與分析

2.1 嗜卷書虱CarE基因全長序列的克隆及分析

利用羧酸酯酶簡并引物擴增，結果顯示有1條與預測長度相符的條帶，經克隆測序后得到2個不同的基因片段，2個片段長度均為344 bp，編碼114個氨基酸，是完整的編碼序列。將2個片段所推導的氨基酸序列進行BLASTP搜索，結果表明，這2個基因片段與其他昆蟲CarE基因具有很高的同源性。

根據克隆獲得的2個CarE基因片段，分別使用擴增3’端和5’端的基因特異引物，利用RACE技術成功地克隆獲得了嗜卷書虱2個CarE基因的全長序列，分別命名為Lbest1(GenBank登錄號：EU854151)和Lbest2(GenBank登錄號：EU854152)。核苷酸及其推導的氨基酸序列見圖1、圖2。

2.2 嗜卷書虱CarE氨基酸序列分析

由表2可知，Lbest1基因全長為2 049 bp，其中開放閱讀框1 713 bp，編碼一個570個氨基酸組成的前體蛋白，N端無信號肽；成熟蛋白的分子質量為61.4 kDa，理論等電點為6.85；Lbest1含有cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點2個，分別對應推導的氨基酸編號為：102～105、283～286；蛋白激酶C磷酸化位點9個，分別對應推導的氨基酸編號為：24～26、281～283、286～288、302～304、390～392、403～405、431～433、462～464和567～569；酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點7個，分別對應推導的氨基酸編號為：46～49、93～96、177～180、302～305、358～361、411～414、519～522。

Lbest2基因全長為2 525 bp，包括由76個核苷酸組成的5’非編碼區序列、由1 854個核苷酸組成的ORF和由595個核苷酸組成的3’非編碼區序列。ORF編碼617個氨基酸組成的前體蛋白，其中包括了由17個氨基酸組成的信號肽；成熟蛋白的分子質量為67.3 kDa，理論等電點為4.74。Lbest2含有cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點1個，對應推導的氨基酸編號為：89～92；蛋白激酶C磷酸化位點5個，分別對應推導的氨基酸編號為：87～89、88～90、353～355、592～594和603～605；酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點10個，分別對應推導的氨基酸編號為：136～139、142～145、292～295、322～325、341～344、347～350、363～366、538～541、543～546以及575～578。另外，通過預測Lbest2還含有2個N-糖基化位點(161和184)。

表2 嗜卷書虱2個全長羧酸酯酶的氨基酸序列特征

將嗜卷書虱和其他昆蟲CarE的氨基酸序列進行多重序列比對。由圖3可見，不同昆蟲CarE之間在活性位點附近的氨基端序列保守性較高，如保守的催化三聯體(GESAG-E-H)、6個保守的半胱氨酸殘基形成三對二硫鍵及FGESAG序列等。

根據在線軟件ScanProsite的算法原理，CarE有2個保守結構域，1個是絲氨酸活性中心：F-[GR]-G-x (4)-[LIVM]-x-[LIV]-x-G-x-S-[STAG]-G，另1個是二硫鍵形成的位點：[ED]-D-C-L-[YT]-[LIV]-[DNS]-[LIV]-[LIV-FYW]-x-[PQR](其中“[ ]”表示不同物種在該位點是其中的1個氨基酸)。本試驗克隆獲得的嗜卷書虱2條CarE經該軟件分析均發現了CarE的保守結構域，Lbest1的絲氨酸活性中心為“FGGDPNKVTIFGESAG”，二硫鍵形成的位點為“EDCLFLNVFTP”；Lbest2的絲氨酸活性中心為“FGGDPNRITLFGESAG”，二硫鍵形成的位點為“EDCLYLNIYSP”。

圖2 嗜卷書虱Lb est2的核苷酸序列及推導的氨基酸序列

2.3 嗜卷書虱CarE氨基酸序列聚類分析

選取雙翅目、鞘翅目、直翅目等共9個代表性昆蟲的CarE氨基酸序列以及本試驗獲得的嗜卷書虱Lbest1、Lbest2序列，參考Oakeshott等[15]對羧酸酯酶的研究方法，使用Mega 5.1 軟件進行Neighbor-Joining聚類分析；結果由圖4可知，Lbest1與Lbest2均被劃分在F簇中，該簇主要由非鱗翅目昆蟲的保幼激素酯酶(juvenile hormone esterase，JHE)組成；F簇屬于第二功能組(Secreted catalytic class)，組內主要包括與激素降解相關的酶類。嗜卷書虱的Lbest1先與黃星天牛、黑腹果蠅、黃粉蟲、蟋蟀的JHE聚類在一起，然后與本試驗獲得的另一個Lbest2匯成一大類。

注：保守的氨基酸殘基用黑色表示，﹡代表活性中心的催化三聯體位點；Md_CarE: 家蠅CarE Musca domestica (AAD29685); Cp_CarE: 庫蚊CarE Culex pipiens quinquefasciatus (EDS26821); Hd_CarE: 棉鈴蟲CarE Helicoverpa armigera (ABQ42338); Lb_est1: 嗜卷書虱CarE1 Liposcelis bostrychophila (EU854151); Lb_est2: 嗜卷書虱 CarE2 Liposcelis bostrychophila (EU854152)。圖3 嗜卷書虱CarE與其他昆蟲酯酶序列的多重比對

注： Ph為黃星天牛; Dm為黑腹果蠅; Tm為黃粉蟲; Ga為蟋蟀; Apol為蠶蛾; AM為蜜蜂; Bm為家蠶; Snon為地中海玉米螟; Slit為斑馬魚圖4 昆蟲CarE和酯酶氨基酸序列的聚類分析

2.4 2條CarE基因在不同品系中的表達水平研究

嗜卷書虱2個CarE基因(Lbest1和Lbest2)在不同品系中的相對表達水平見圖5。在嗜卷書虱體內Lbest2的表達水平顯著高于Lbest1，在敵敵畏抗性品系、磷化氫抗性品系以及敏感品系中的比值分別達到2.22、1.85和1.65倍(P<0.05)。其中Lbest1在抗性品系中的表達水平高于敏感品系，但差異未達顯著水平(P>0.05)。Lbest2在兩抗性品系中的表達水平均顯著高于敏感品系(P<0.05)，其中在敵敵畏抗性品系中的表達水平最高，達到敏感品系的1.9倍，在磷化氫抗性品系中的表達水平是敏感品系的1.4倍。

注：同一顏色柱上不同字母表示差異顯著 (P<0.05)，余同。圖5 嗜卷書虱2個CarE基因在不同品系中表達水平的比較

2.5 藥劑處理對CarE基因mRNA表達水平的影響

從圖6中可以看出，敵敵畏和磷化氫均可誘導嗜卷書虱體內2個CarE基因的過量表達。Lbest1經敵敵畏和磷化氫處理后表達量分別是對照的1.76和1.47倍，三者之間差異達顯著水平(P< 0.05)。同樣，Lbest2經敵敵畏和磷化氫處理后表達量分別是對照的1.65和1.84倍。

圖6 嗜卷書虱2個CarE基因在藥劑處理前后表達水平的比較

2.6不同發育階段CarE基因mRNA表達水平的研究

嗜卷書虱CarE基因在不同發育階段的相對表達水平見圖7。Lbest1在低齡若蟲期的表達水平較高，但隨著昆蟲的生長發育表達水平逐漸降低，成蟲期表達水平最低。Lbest2在若蟲期的表達水平較低，且在4個若蟲齡期間的表達水平差異不顯著，但都顯著低于成蟲期的表達水平(P<0.05)。

圖7 嗜卷書虱2個CarE基因在不同發育階段表達水平的比較

3 討論

本研究從嗜卷書虱體內克隆得到2個CarE基因的全長序列，通過軟件預測到2條基因均存在多個磷酸化位點，Lbest1無信號肽，所以也無糖基化位點，為非糖基化蛋白，這與Vaughan等[16]對蚊蟲羧酸酯酶的結果類似，由此推測其并非胞內蛋白。而Lbest2預測到2個糖基化位點，糖基化修飾是生物體內最為重要的蛋白質翻譯后修飾形式之一，有研究表明，糖基化修飾可以增強羧酸酯酶的穩定性[17-18]，使用SignalP 3.0預測結果顯示5’端有17個氨基酸組成的信號肽序列，因此該蛋白為分泌型蛋白。

聚類分析結果顯示，Lbest1與Lbest2均被劃分在F簇中，該簇主要由非鱗翅目昆蟲的保幼激素酯酶組成[15]。保幼激素是昆蟲發育和繁殖過程中的關鍵激素，會由于保幼激素酯酶的水解作用而影響其濃度高低，從而調節昆蟲的生長發育[19-21]。有研究發現，具有水解保幼激素功能的氨基酸其催化三聯體為S-E-H[22]，這與本研究發現的Lbest1與Lbest2催化三聯體序列一致。因此推測Lbest1與Lbest2在嗜卷書虱變態發育過程中起重要的調節作用。

基因定量分析結果顯示，Lbest1在不同品系中的表達水平差異不顯著；而不同發育時期的定量結果表明，該基因隨著昆蟲的生長發育表達水平逐漸降低，成蟲期表達水平最低；結合聚類分析結果，認為Lbest1主要在調節昆蟲的生長發育過程中起到重要作用。Lbest2在敵敵畏抗性品系中的表達水平最高，達到敏感品系的1.9倍，在磷化氫抗性品系中的表達水平是敏感品系的1.4倍，且2種藥劑均可誘導該基因表達上調，說明Lbest2與敵敵畏和磷化氫的抗性有關。前人研究表明，羧酸酯酶介導害蟲抗藥性主要是通過提高對殺蟲劑的水解活性，增強對殺蟲劑的阻隔或者改變酶與底物的親和力來發揮作用[23-24]，而羧酸酯酶基因mRNA表達量的增加常常導致昆蟲抗藥性的增強[25-26]。嗜卷書虱Lbest2在抗性品系中的表達水平顯著高于敏感品系而且在受到藥劑處理時過量表達，由此推測Lbest2主要參與外源性物質的降解，具有代謝解毒的功能。

4 結論

本研究成功擴增了2條嗜卷書虱CarE基因，通過軟件預測、同源性比對、qRT-PCR技術以及聚類分析等研究方法，比較并分析了2條嗜卷書虱CarE可能具有的功能，從而為解析嗜卷書虱生長發育過程及抗藥性形成的機理以及嗜卷書虱抗藥性治理提供了參考。

[1]Zhang Y, Wang L, Guo H, et al. A transcriptome-based screen of carboxylesterase-like genes that are involved in chlorpyrifos resistance inLaodelphaxstriatellus(Fallén)[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2012, 104(3): 224-228

[2]He P, Zhang Y N, Yang K, et al. An antenna-biased carboxylesterase is specifically active to plant volatiles inSpodopteraexigua[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2015, 123: 93-100

[3]Lü F G, Fu K Y, Li Q, et al. Identification of carboxylesterase genes and their expression profiles in the Colorado potato beetleLeptinotarsadecemlineatatreated with fipronil and cyhalothrin[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2015, 122: 86-95

[4]Wei P, Shi L, Shen G, et al. Characteristics of carboxylesterase genes and their expression-level between acaricide-susceptible and resistantTetranychuscinnabarinus(Boisduval)[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2016, 131: 87-95

[5]Dou W, Xiao L S, Niu J Z, et al. Characterization of the purified glutathione S-transferases from two psocidsLiposcelisbostrychophilaandL.entomophila[J]. Agricultural Sciences in China, 2010, 9(7): 1008-1016

[6]Grigoraki L, Balabanidou V, Meristoudis C, et al. Functional and immunohistochemical characterization of CCEae3a, a carboxylesterase associated with temephos resistance in the major arbovirus vectorsAedesaegyptiandAe.albopictus[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2016, 74: 61-67

[7]Vontas J G, Hejazi M J, Hawkes N J, et al. Resistance—associated point mutations of organophosphate insensitive acetylcholinesterase, in the olive fruit flyBactroceraoleae[J]. Insect Molecular Biology, 2002, 11(4): 329-336

[8]Yang X Q. Gene expression analysis and enzyme assay reveal a potential role of the carboxylesterase gene CpCE-1 fromCydiapomonellain detoxification of insecticides[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2016, 129: 56-62

[9]許雄山, 韓召軍, 王蔭長. 羧酸酯酶與棉鈴蟲對有機磷殺蟲劑抗性的關系[J]. 南京農業大學學報, 1999, 22(4): 41-44

Xu X S, Han S J, Wang Y C. Relationship between carboxylesterase and organophosphate resistance in Helicoverp aarmigera (Hübner) [J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 1999, 22(4): 41-44

[10]邱艷, 宋旭紅, 黃衍章. 玉米象成蟲對 β-細辛醚中毒的行為反應及殺蟲機理研究[J]. 中國糧油學報, 2014, 29(7): 80-85

Qiu Y, Song X H, Huang Y Z.Research on behavior response and insecticidal mechanism of β-asarone against Sitophilus zeamais adult[J].Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2014, 29(7): 80-85

[11]張建琴, 葛娉婷, 李大琪, 等. 飛蝗羧酸酯酶基因 LmCesF1 的時空表達及與殺蟲劑耐受性的關系[J]. 中國農業科學, 2014, 47(8): 1522-1530

Zhang J Q, Ge P T, Li D Q, et al. Spatio-Temporal Expression and insecticide tolerance analysis of carboxylesterase gene LmCesF1 from locusta migratoria[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2014, 47(8): 1522-1530

[12]劉蘇, 馮明峰, 何夢竹. 稻縱卷葉螟羧酸酯酶基因的鑒定與表達譜分析[J]. 應用昆蟲學報, 2015, 52(3): 662-670

Liu S, Feng M F, He M Z. Identification and expression profiles of Cnaphalocrocis medinalis carboxylesterase genes[J]. Chinese Journal of Applied Entomology, 2015, 52(3): 662-670

[13]楊帥, 王玲, 趙奎軍, 等. 大豆蚜羧酸酯酶基因 AgCarE 的克隆, 表達及活性分析[J]. 中國農業科學, 2012, 45(18): 3755-3763

Yang S, Wang L, Zhao K J, et al. Cloning, expression and activity analysis of Carboxylesterase gene from Aphis glycines (Hemiptera: Aphididae) [J]. Scientia Agricultura Sinica, 2012, 45(18): 3755-3763

[14]Wang J J, Tsai J H, Zhao Z M, et al. Development and reproduction of the psocidLiposcelisbostrychophila(Psocoptera: Liposcelididae) as a function of temperature[J]. Annals of the Entomological Society of America, 2000, 93(2): 261-270

[15]Yu Q Y, Lu C, Li W L, et al. Annotation and expression of carboxylesterases in the silkworm,Bombyxmori[J]. BMC Genomics, 2009, 10(1): 553

[16]Vaughan A, Hemingway J. Mosquito carboxylesterase Estα21 (A2). Cloning and sequence of the full-length cDNA for a major insecticide resistance gene worldwide in the mosquitoCulexquinquefasciatus[J]. Journal of Biological Chemistry, 1995, 270(28): 17044-17049

[17]周蕾, 顧建新. N-糖基化位點鑒定方法和非經典 N-糖基化序列[J]. 生命科學, 2011, 23(6): 605-611

Zhou L, Gu J X. N-glycosylation sites analysis and nonconsensus N-glycosylated sequences[J].Chinese Bulletin of Life Sciences, 2011, 23(6):605-611

[18]Kroetz D L, McBride O W, Gonzalez F J. Glycosylation-dependent activity of baculovirus-expressed human liver carboxylesterases: cDNA cloning and characterization of two highly similar enzyme forms[J]. Biochemistry, 1993, 32(43): 11606-11617

[19]Kamita S G, Hammock B D. Juvenile hormone esterase: biochemistry and structure[J]. Journal of Pesticide Science, 2010, 35(3): 265

[20]Zhang Y, Li S, Xu L, et al. Overexpression of carboxylesterase-1 and mutation (F439H) of acetylcholinesterase-1 are associated with chlorpyrifos resistance inLaodelphaxstriatellus[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2013, 106(1): 8-13

[21]Zhang J, Ge P, Li D, et al. Two homologous carboxylesterase genes fromLocustamigratoriawith different tissue expression patterns and roles in insecticide detoxification[J]. Journal of Insect Physiology, 2015, 77: 1-8

[22]Oakeshott J, Claudianos C, Campbell P M, et al. Biochemical genetics and genomics of insect esterases[J]. Comprehensive Molecular Insect Science, 2005, 5: 309-381

[23]Li X, Schuler M A, Berenbaum M R. Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics[J]. Annual Review of Entomology, 2007, 52: 231-253

[24]Li F, Han Z. Mutations in acetylcholinesterase associated with insecticide resistance in the cotton aphid,AphisgossypiiGlover[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2004, 34(4): 397-405

[25]Feng Q L, Ladd T R, Tomkins B L, et al. Spruce budworm (Choristoneurafumiferana) juvenile hormone esterase: hormonal regulation, developmental expression and cDNA cloning[J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 1999, 148(1): 95-108

[26]Huang S J, Qin W J, Chen Q. Cloning, sequence analysis and expression levels of a carboxylesterase gene fromSpodopteralitura(Fab.)(Lepidoptera: Noctuidae)[J]. Acta Entomologica Sinica, 2010, 53(1): 29-37.

Gene Cloning of Carboxylesterases and mRNA Expression Level inLiposcelisBostrychophila

Tang Peian1Li Feifan1Wang Jinjun2Shen Fei1Song Wei1

(College of Food Science and Engineering; Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety. Nanjing University of Finance and Economics1, Nanjing 210023) (Key Laboratory of Entomology and Pest Control Engineering, Southwest University2, Chongqing 400716)

The objective of this study was to explore the function of carboxylesterase gene in pesticide detoxification. TheLbest1 andLbest2 encoding CarE (GenBank Accession No are EU854151 and EU854152) were cloned fromL.bostrychophilain the way of reverse transcriptase PCR (RT-PCR) and rapid amplification of cDNA ends (RACE). Full-length of these two genes were 2 049 and 2 525 bp, encoded 570 and 617 amino acids, the isoelectric point were 6.85 and 4.74 respectively. Phosphorylation sites were predicted and gene sequences were analyzed, both two genes contained the catalytic activity sites and conserved sequences of the insect carboxylesterase gene as a result. Cluster analysis showed that these two genes were clustered in clade F catalytic activity sites. qRT-PCR (quantitative real time PCR) was used to test the mRNA expression level of these two carboxylesterase gene among different strains, different developmental stages, and after treatment by DDVP or PH3were also studied. Based on the results, it was concluded thatLbest1 could regulate the growth and development of insects,Lbest2 might play an important role in metabolic detoxification and degradation of exogenous substances.

liposcelisbostrychophila, carboxylesterases, resistance mechanism, gene clone

S482.6

A

1003-0174(2017)10-0130-10

國家重點研發專項(2016YFD0401004、2017YFD040 1003)，糧食公益性行業科研專項(201413007-2、201513002-5)，江蘇高校優勢學科建設工程資助(JSYXK201403)

2017-04-30

唐培安，男，1981年出生，副教授，糧食儲藏

王進軍，男，1970年出生，教授，昆蟲學