印度南瓜果皮結構與色素組成對果皮顏色的影響

段 穎 向成鋼 劉新艷 馬 瑋 孫廷珍 王長林

（中國農業科學院蔬菜花卉研究所，農業部園藝作物生物學與種質創制重點試驗室，北京 100081）

印度南瓜果皮結構與色素組成對果皮顏色的影響

段 穎 向成鋼 劉新艷 馬 瑋 孫廷珍 王長林*

（中國農業科學院蔬菜花卉研究所，農業部園藝作物生物學與種質創制重點試驗室，北京 100081）

利用色差儀對65份印度南瓜種質進行果皮顏色分類，并從中選取8份代表性種質（枕瓜、吊瓜、金星、99N48、打木赤、S8844、雪化粧、無名綠），通過體式解剖鏡和高效液相色譜分析果皮結構以及果皮色素組成對果皮顏色的影響。結果表明：① 利用色差儀將65份種質果皮顏色聚類為三大色系（黃色系、紅色系、綠色系）共6類，并確定各類L、A、B、C、H值的變化范圍；② 綠色系果皮主要色素成分為葉綠素，紅色系果皮從淺橙色到深紅色變化與類胡蘿卜素總含量及組成有關，黃色系果皮中葉綠素和類胡蘿卜素含量都較低；③ 解剖學觀察顯示果皮色素含量與果實成熟期中果皮色素層厚度相關性較高，與花托、子房壁、外果皮厚度相關性較低。對印度南瓜果皮外觀顏色性狀選育時，應綜合考慮果實成熟期果皮結構和色素組成的共同影響。

印度南瓜；果皮顏色；果皮結構；色素組成；類胡蘿卜素

印度南瓜（Cucurbita maxima）起源于南美洲，是葫蘆科南瓜屬3個主要栽培種之一，果實口感甜面，營養價值高，是我國北方地區重要的菜糧兼用作物。印度南瓜果實為瓠果，外果皮與花托融合形成較為堅實的果皮，在幼果期呈淺黃或淺綠色，至成熟期顏色變深，某些品種可轉色為紅色或橙色。由于果皮顏色是判斷果實成熟的主要評價指標，消費市場對于深色果皮品種，特別是深紅色品種具有較強的選擇傾向，因此研究印度南瓜果皮顏色形成機制，對于種質資源創新與開發利用具有重要意義（徐麗麗 等，2015；段穎 等，2016）。

目前對印度南瓜果皮顏色形成機制的研究主要集中在利用多世代群體進行遺傳規律分析上，并篩選獲得一些與特定顏色緊密連鎖的分子標記（向成鋼，2013；李雪，2014；葛宇 等，2015；Ge et al.，2015）。利用近等基因系已在美洲南瓜和印度南瓜中確定了大約20個果皮顏色調控位點，如 B（Bicolor），D（Dark green stem），l-1（light fruit color-1）、l-2（light pigmentation on fruit-2）等，然而這些顏色調控位點之間的遺傳互作關系尚未完全明確（Paris & Brown，2005；Paris &Kabelka，2009）。

采用色差儀對果皮、果肉顏色進行定量描述的研究方法在番茄、黃瓜等作物研究中多有報道（國艷梅 等，2008；沈鏑 等，2011）。目前印度南瓜果皮顏色性狀的研究以主觀目測為主，限于性狀描述方法的精準度，對“紅色/綠色”、“白色/綠色”等性狀研究較多，而對實際生產中經常遇到的“橘紅色/紅色”、“灰綠/深綠”等較為接近的過渡色調控機制研究較少。本試驗采用色差儀對65份印度南瓜種質的果皮顏色進行測量和聚類，以期建立印度南瓜果皮顏色性狀的分類范圍，并在不同發育階段研究果皮結構和色素組成對果皮顏色的影響，為印度南瓜果實外觀品質的選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2016年2 月將65份印度南瓜種質定植于中國農業科學院蔬菜花卉研究所廊坊試驗基地，株行距為 90 cm，常規栽培管理。以第1雌花為主進行自交授粉，于授粉當日及授粉60 d后取長勢一致且無機械損傷的果實進行后續各項測定。

1.2 果皮表面顏色測定

利用HP-200型色差儀測定果皮表面顏色，其中L表示果皮顏色深淺；A表示果皮顏色的紅綠程度，其中負值表示偏綠，正值表示偏紅；B表示果皮顏色的黃藍程度，其中負值表示偏藍，正值表示偏黃。分別對所有株系的果實表皮色差進行測定，每個果實進行3次重復測量。利用公式計算色度值Chroma value（C），C2=A2+B2， 色 調 角 Hue angle（H）=Degrees〔arctan（B/A）〕（Itle & Kabelka，2009）。

1.3 果皮結構測定

取不同發育階段的果皮，利用Leica體式鏡進行觀察并拍照測量果皮各層厚度，各株系果實進行5次重復。

1.4 果皮色素主要成分分析及含量測定

授粉60 d后用刀剝取南瓜果實鮮果皮，凍干機處理24 h，研磨成干粉，錫箔紙包好后放入-80℃冰箱保存。采用分光光度法進行葉綠素和總類胡蘿卜素提取和含量測定（波欽諾克，1981；孫小鐳等，2004）。

采用HPLC法測定果皮類胡蘿卜素種類及含量，根據王慧等（2014）的方法并稍作修改。樣品前處理：稱取0.500 g冷凍干粉，置于研缽中，加入石英砂后再加入適量丙酮-石油醚（V∶V=1∶1，0.1% BHT）混合溶液至樣品完全浸沒，研棒充分研磨后轉至砂心漏斗中真空抽濾，濾液收集于試管中，遵循少量多次原則，重復上述提取步驟直至試樣洗脫至無色。將全部濾液轉移至圓底燒瓶中，置于35 ℃水浴的旋轉蒸發儀上濃縮至干，10.0 mL乙腈-丙酮（V∶V=1∶1）充分溶解，0.22 μm微孔濾膜過濾，上機測定。

儀器測定參數：超高效液相色譜儀（Ultra-Performance Liquid Chromatography，UPLC， 美 國Waters公司），色譜柱：ACQUITY CSH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm；美國 Waters公司），流動相為乙腈和丙酮，梯度洗脫程序，流速為0.25 mL·min-1，檢測波長450 nm，色譜柱溫度：30 ℃，樣品室溫度：10 ℃，進樣量2.00 μL。葉黃素、玉米黃質、β-隱黃質、番茄紅素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素等標準品均購自美國Sigma公司。

1.5 數據分析統計

采用Excel 2013及SPSS 23.0軟件進行南瓜果皮結構數據統計、各類色素成分分析及相關性分析。

2 結果與分析

2.1 供試材料果實外觀性狀描述

選用不同果實外觀顏色的印度南瓜種質共65份，利用色差計在每個果實表面選取3個不同位置分別測定表皮色彩亮度（L）、紅綠值（A）、黃藍值（B），并計算色度值（C）和色調角（H）。通過SPSS 23.0對各材料表面色差值進行聚類分析，將印度南瓜分為黃色、紅色、綠色三大色系。根據測定各色系的L、A、B、C、H值的變化范圍，將65份材料進一步劃分為6類，其中黃色系種質2份；紅色系種質共17份，其中包括11份橙色和6份紅色種質；綠色系種質共46份，包括灰綠色種質22份，綠色6份，墨綠色18份（表1）。

根據聚類結果，從65份材料中選定色差值處于相應顏色分組均值附近的代表性材料8份進行后續研究，分別為：黃色系材料枕瓜，紅色系材料吊瓜、金星、99N48、打木赤，綠色系材料S8844、雪化粧、無名綠，其外觀描述詳見表2和圖1。

2.2 不同發育時期果皮解剖結構觀察

南瓜果實為瓠果，果實外壁起源于外果皮和花托，中果皮和內果皮起源于子房壁，界限不分明。為研究不同發育時期各層果皮厚度對果皮顏色性狀的影響，對雌花花托、授粉當日子房壁、成熟果實果皮各層厚度進行測量分析。結果顯示（表3），在黃色系和紅色系5份種質中，R3（99N48）花托厚度最小，約為其他4份種質的50%；授粉當日子房壁厚度較大的是R1（吊瓜）和R3（99N48），與其他3份種質相差近25%；果實成熟期外果皮厚度從大到小依次為R3（99N48）＞Y1（枕瓜）＞R2（金星）＞R4（打木赤）＞R1（吊瓜）。對中果皮色素層厚度測定結果顯示，4份紅色系種質中，R3（99N48）的主色素層和副色素層厚度均較大，其次為R2（金星），R1（吊瓜）和R4（打木赤）較為接近。R3（99N48）的外果皮和中果皮主色素層厚度分別是R4（打木赤）的1.5倍和3.0倍。由此可見，在果實發育過程中，R3（99N48）的果皮由薄變厚的變化時間最早，且變化幅度最為明顯，R1最不明顯。

表1 65份供試材料果實外觀顏色的色差分析

表2 供試材料名稱及果面外觀描述

圖1 供試材料外觀顏色分類及名稱

表3 供試材料不同發育階段各層果皮厚度測定

在3份果皮綠色系種質中，果實發育早期花托厚度差異較小，在2.23～2.86 mm之間，但果實成熟后的差異較為明顯，G1和G3外果皮厚度僅為G2的42%～45%，但中果皮主色素層厚度為G2的1.4～1.8倍。G1和G2的副色素層較薄且較接近，厚度分別為G3的16%～26%（表3）。

為進一步研究不同種質在果實成熟期的果皮結構差異，對成熟果實進行縱切解剖并利用體式顯微鏡觀察各層果皮結構特征。由圖2可知，各色系種質的果實外觀顏色與中果皮主色素層顏色（圖2中黑色箭頭）基本一致，但最外層果皮（果壁，圖2中白色箭頭）形態差異較為明顯。其中R2、R3、G1、G2果壁極厚，透明度較差，連續分布于果實外側，對主色素層呈色的遮蓋程度極大；Y1、G3果壁較薄，對主色素層呈色的遮蓋程度較小。

此外，還觀察到果實表面的條紋和凹陷對果皮外觀顏色存在一定影響。R1（吊瓜）果實表面橙紅色，心皮脈絡叢對應的果皮位置有白色條紋，解剖鏡下觀察到條紋下方主色素層的色素積累少于橙色部分（圖2中R1畫*處），在中果皮副色素層基本沒有差異。3份綠色系材料果皮外表面存在凹陷區域，縱切后觀察到外果皮厚度不連續現象（圖2中G3畫**處），初步推測這些凹陷是由于果皮不同層細胞在某些特定部位發生分離或粘連所致，對果實外觀明亮度產生影響，其成因有待進一步研究。

2.3 成熟果皮色素成分分析

為明確不同色素種類及含量對果皮外觀的影響，利用分光光度法對果皮葉綠素a、葉綠素b、總類胡蘿卜素含量進行測定。結果表明（表4），綠色系種質的葉綠素含量大大高于紅色系種質，是決定果皮呈現紅色或綠色的最主要色素。在3份綠色系種質中，G1（S8844）和G2（雪化粧）各色素含量測定結果較為接近，G3（無名綠）各色素含量均極顯著高于G1（S8844）和G2（雪化粧），尤其是G3（無名綠）的葉綠素a含量高達1 623.52 μg·g-1（FW）。在5份黃色或紅色系種質中，Y1（枕瓜）3種色素含量均處于較低水平；R3（99N48）和R4（打木赤）的類胡蘿卜素含量極顯著高于R1（吊瓜）和R2（金星），且幾乎是R1、R2的2～5倍，表明類胡蘿卜素是決定紅色系果皮呈色深淺的主要原因。

圖2 成熟果實果皮縱面結構

表4 供試材料果皮主色素層色素成分測定

為明確果實外觀顏色與類胡蘿卜素含量之間的聯系，利用HPLC法對類胡蘿卜素代謝途徑中的β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質、β-隱黃質和番茄紅素等含量進行分析。其中，α-胡蘿卜素和番茄紅素在各樣品中均未檢出。對于檢測到的4種類胡蘿卜素，含量分析結果顯示（表5），黃色系種質中，Y1（枕瓜）各種類胡蘿卜素含量均極低。紅色系種質中，R4（打木赤）各種類胡蘿卜素含量最高，其中β-胡蘿卜素約為其他種質的1.8～5.3倍，葉黃素約為6.1～9.1倍，β-隱黃質約為1.4～1.7倍，與其顏色深淺密切相關。此外，在R4（打木赤）中檢測到玉米黃質含量高達1 337.70 μg·g-1（DW），而其他紅色系種質約為5.33～58.81 μg·g-1（DW）。綠色系種質中，β-胡蘿卜素和葉黃素含量均較高，G1、G2中未檢測出β-隱黃質。

2.4 果皮結構、色素組成及果皮外觀的相關性分析

為明確果皮結構與色素構成對果實外觀的影響，利用SPSS 23.0對果皮結構、色素組成及果皮外觀各項指標進行相關性分析。結果顯示（表6），花托厚度、子房壁厚度與外果皮厚度之間的相關性較低，說明南瓜果皮的次生加厚過程受到多種因素的共同影響。中果皮主色素層厚度與3種色素含量之間的相關系數分別達到0.793、0.868和0.704，副色素層厚度與果皮色素含量之間的相關系數分別達到0.864、0.718和0.627，說明主色素層和副色素層厚度對果皮色素含量的影響較大；總的來看，花托厚度、子房壁厚度與各色素含量相關性較低，說明果實發育早期結構對果皮顏色影響較小。

表5 供試材料果皮類胡蘿卜素含量測定

表6 果皮結構、色素組成及果皮外觀的相關性分析

3 結論與討論

印度南瓜果皮顏色是品種選育過程中重點關注的品質性狀之一（Murkovic et al.，2002）。在印度南瓜中，已經利用色差儀法成功建立果肉顏色量化指標與色素含量之間的線性回歸方程（Itle &Kabelka，2009），而利用色差儀對果皮顏色進行研究尚不多見。本試驗對65份印度南瓜的果皮色彩亮度、紅綠值、黃藍值進行定量并計算色度值和色調角，將其劃分為三大色系6類，明確了“橘紅色/紅色”、“灰綠色/綠色/墨綠色”等過渡色性狀的定量范圍，為后續研究過渡色的調控機制奠定了基礎。

目前尚未建立起印度南瓜果皮顏色性狀與色素代謝途徑基因之間的遺傳連鎖關系，推測果皮顏色可能受多種途徑共同調控（Paris & Kabelka，2009）。本試驗明確了果皮由淺至深的色調變化受到果皮結構和色素組成的共同影響，其中，果皮色素含量與果實成熟期中果皮色素層厚度的相關性較高，與果實發育早期的花托、子房壁厚度及成熟期果實外果皮厚度的相關性較低。本試驗還發現外果皮本身存在的不規則凹陷，對果實外觀呈色和明亮度均會造成影響。研究結果為印度南瓜果皮顏色調控具有多個遺傳互作位點提供了佐證。

西瓜、番茄、胡蘿卜的果肉或肉質根呈紅色或橙色與類胡蘿卜素組成和含量密切相關（國艷梅 等，2008；王慧 等，2014；王楠 等，2016）。印度南瓜代謝組學分析顯示，類胡蘿卜素種類和含量的差異使果皮呈現鮮艷程度不等的紅色調（Kreck et al.，2006；Azevedo-Meleiro & Rodriguez-Amaya，2007）。類胡蘿卜素合成途徑中，番茄紅素ε-環化酶和番茄紅素β-環化酶是合成葉黃素或β-胡蘿卜素的分支酶，兩者的比例決定了果實最終的呈色。類胡蘿卜素合成前體番茄紅素可由番茄紅素ε-環化酶催化形成α-胡蘿卜素，并經CHXB和CHXE催化形成葉黃素，也可由番茄紅素β-環化酶催化形成γ-胡蘿卜素并轉變為β-胡蘿卜素，經β-隱黃質最終形成玉米黃質（Harjes et al.，2008；朱運欽 等，2016）。轉錄組測序顯示南瓜屬作物至少存在18個類胡蘿卜素合成、貯存和降解相關基因，并且一些基因功能已通過實時熒光定量PCR進行驗證（Nakkanong et al.，2012；Wyatt et al.，2015）。本試驗中，紅色果皮顏色深度與類胡蘿卜素含量正相關，且果皮顏色最為鮮艷的R4（打木赤）類胡蘿素含量均顯著高于其他紅色系種質，在果皮中檢測到大量β-胡蘿卜素、玉米黃質和β-隱黃質，未檢測到番茄紅素和α-胡蘿卜素，且代表2個分支方向的葉黃素與玉米黃質含量的比值在這4份紅色種質中最低，說明紅色果皮類胡蘿卜素合成途徑更傾向于由番茄紅素向β-胡蘿卜素的分支方向進行，番茄紅素β-環化酶有可能作為紅色系種質品種選育的重要改良位點。

為明確印度南瓜果皮顏色調控機制，后續研究可重點關注中果皮色素層及果皮外壁的起源與發育進程，以及不同種質類胡蘿卜素合成途徑關鍵酶編碼基因的序列變異、轉錄水平、蛋白活性等方面，從而對印度南瓜果實外觀性狀的選擇進行指導，提高重要調控基因或QTL連鎖位點的利用效率，以滿足市場對果皮外觀性狀多樣化的育種需求。

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Effect of Rind Structure and Pigment Composition on Rind Color in Cucurbita maxima

DUAN Ying，XIANG Cheng-gang，LIU Xin-yan，MA Wei，SUN Ting-zhen，WANG Chang-lin*

（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops，Ministry of Agriculture，Beijing 100081，China）

This study classified the rind color of 65 Cucurbita maxima cultivars by colorimeter and selected 8 representative germplasm resources（‘Zhengua’，‘Diaogua’，‘Jinxing’，‘99N48’，‘Damuchi’，‘S8844’，‘Xuehuazhuang’ and ‘Wuminglyu’）to analyze the effect of rind structure and pigment composition on rind color．The result showed that 65 cultivars were classified by colorimeter into 3 color serials（yellow，red and green）a total of 6 classes and determined variation range of L，A，B，C and H value．The main pigment content in green serials was chlorophyll．In red serials the rind color changed from light orange to deep red related with the total content and composition of carotenoid．The contents of chlorophyll and carotenoid in yellow serials were all lower．Anatomical observation showed the pigment content had a higher correlation with the thickness of mesocarp pigment layer and a lower correlation with the thickness of torus，ovary wall and epicarp．The joint effect of rind structure and pigment composition during fruit maturing stage should be considered comprehensively in Cucurbita maxima appearance characteristics selection and breeding.

Cucurbita maxima；Rind color；Rind structure；Pigment composition；Carotenoid

段穎，女，助理研究員，專業方向：南瓜遺傳育種，E-mail：duanying@caas.cn

*

（Corresponding author）：王長林，男，副研究員，碩士生導師，專業方向：南瓜遺傳育種，E-mail：wangchanglin@caas.cn

2017-03-06；接受日期：2017-07-18

農業部中央級公益性科研院所基本科研專項（1610102016016），中國農業科學院創新工程資助項目（CAASASTIP-2013-IVFCAAS），公益性行業（農業）科研專項經費資助項目（201303112）