microRNA -125b對人視網膜母細胞瘤增殖和凋亡作用實驗研究*

田冰玉 ,白淑瑋，康前雁

1.西安交通大學第一附屬醫院眼科(西安 710061)，2.西安市第四醫院眼科(西安710004)

·基礎研究·

microRNA -125b對人視網膜母細胞瘤增殖和凋亡作用實驗研究*

田冰玉1,2,白淑瑋2，康前雁1△

1.西安交通大學第一附屬醫院眼科(西安 710061)，2.西安市第四醫院眼科(西安710004)

目的:探討microRNA -125b(miR -125b)在人視網膜母細胞瘤細胞中的表達，及其對腫瘤細胞增殖抑制和誘導凋亡的作用。方法：采用RT-PCR方法檢測miR -125b在視網膜母細胞瘤細胞系Y79中的表達；構建miR-125b過表達(miR-125bmimic)和抑制載體(miR-125inhibitor)轉染Y79細胞，檢測miR-125b表達情況；通過細胞凋亡實驗和細胞增殖實驗(CCK-8)觀察miR-125b過表達和抑制表達后，對腫瘤細胞增殖力和凋亡的影響。結果：miR-125b在人視網膜母細胞瘤細胞系中Y79細胞系中呈高表達；miR-125bmimic組(Y79+miR-125bmimic)中miR-125b的表達較miR-NC組(未處理的Y79細胞)表達顯著增多，差異具有統計學意義(P<0.05); miR-125binhibitor組(Y79+miR-125binhibitor)中miR-125b的表達較miR-NC組表達顯著減少，差異具有統計學意義(P<0.05)；miR-125bmimic組較miR-NC組相比,Y79細胞增殖力顯著增高，細胞凋亡顯著下降，差異具有統計學意義(P<0.05)；而miR-125inhibitor組較miR-NC組相比腫瘤細胞增殖力顯著下降，細胞凋亡率顯著提高，差異具有統計學意義(P<0.05)。miR-125b可能是通過DRAM2基因來發揮其致癌作用；結論：miR-125b 可能作為癌基因在視網膜母細胞瘤中發揮作用，并對腫瘤細胞增殖和凋亡具有顯著影響。

視網膜母細胞瘤(Retinoblastoma，RB)是人視網膜最常見的眼內惡性腫瘤,多發病于嬰幼兒，在世界范圍內，發病率為每1/15000～1/20000,每年的新增病例為9000例[1]。眼球摘除一直是RB患兒較為普遍的治療手段，現國內外很多學者致力于研究保留RB患兒的眼球及有用視力，提高患兒的生活質量。現在越來越多的證據表明，microRNA廣泛參與各種腫瘤的發生發展與復發轉移[2]。很多研究報道指出miR -125b參與了多種腫瘤的增殖和侵襲[3]。本研究目的為探討miR -125b對人視網膜母細胞瘤細胞增殖抑制及誘導凋亡的作用，尋求RB治療新的分子靶點。

材料和方法

1 材 料 人視網膜母細胞瘤Y79細胞，培養液采用含10%胎牛血清+RPMI 1640 培養液 ,在37 ℃、含5%的CO2飽和濕度下培養，Y79腫瘤細胞呈懸浮生長，取對數生長期Y79細胞進行后續實驗。

2 方 法

2.1 RNA的提取：使用 Trizol 試劑盒提取細胞總 RNA(miR-125b引物序列， 5’-GUAAUGAUUAUGAUUCUCAGGGA-3’)，莖環引物反轉錄反應合成 miRNA 第 1 鏈 cDNA，進行 SYBR GREEN PCR 擴增。反應條件:94 ℃ 變性20 s; 94 ℃，30 s; 60 ℃，45 s，共40個循環，每個樣本重復3次。

2.2 腫瘤細胞轉染 ：轉染試劑脂質體2000(Life Technologies)，轉染按照說明書進行，構建miR-125b過表達和抑制載體(由上海吉瑪制藥技術有限公司合成),分為四組：未處理的Y79細胞(miR-NC組)，Y79細胞+ miR-125bmimic(miR-125bmimic組)，Y79細胞+ miR陰性對照組(anti-miR)，Y79細胞+ miR-125inhibitor(miR-125inhibitor組)-。

2.3 CCk-8試驗檢測細胞存活率：收集上述四組細胞，轉染24h后，上述四組實驗組每孔加入90μl，細胞密度約5×103個接種于96 孔培養板中，每組3個孔，空白對照加入100μl 培養液，每孔加入10μl CCK-8 試劑，再孵育2h，然后用酶標儀測定的吸光度值(450nm 波長)。按照以下公式計算細胞存活率。細胞存活率(%)= [(實驗孔-空白孔)/(對照孔-空白孔)]×100%，其中實驗孔(miR-125bmimic/anti-miR/miR-125inhibitor+CCK-8 ；對照孔(miR-NC+CCK-8)；空白孔(培養基+CCK-8)。實驗重復3次，取平均值。

2.4 細胞凋亡實驗：收集上述四組細胞轉染24h后，細胞密度達1×106/ml，取100μl細胞懸液放入1.5ml離心管中，按照檢測凋亡試劑盒(Annexin V-FITC ，BD Pharmingen)進行實驗，流式細胞儀檢測。

2.5 蛋白檢測:收集以上四組細胞，轉染24h后，細胞總蛋白的提取，應用BCA 蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)。每組取30μg蛋白樣本，進行電泳分離，電轉移蛋白島硝酸纖維膜，封閉液封閉后，進行免疫雜交，加入稀釋的一抗兔抗人DRAM2多克隆抗人(Santacruz公司)，4℃過夜后，TBS液清洗，而后加入辣根過氧化物酶標記的鼠抗兔IgG二抗(Santacruz公司)1h后，顯色、曝光、顯影，其中β-action為內參。

2.6 統計學方法：使用SPSS 19.0統計學軟件，計數資料采用獨立樣本t檢驗，P<0.05 表示差異具有統計學意義。

結 果

1 miR-125b在Y79細胞中的表達 Y79細胞和視網膜色素上皮細胞(ARPE-19)相比， miR-125b表達顯著增高，差異有統計學意義(P<0.05)(圖1)。

2 Y79細胞在轉染后miR-125b的表達 miR-NC和anti-miR組miR-125b的表達量相當，差異未見統計學意義(P>0.05)；miR-125bmimic組較miR-NC和anti-miR組miR-125b的表達量顯著增多，差異具有統計學意義(P<0.05) ；miR-125binhibitor組較miR-NC和anti-miR組miR-125b的表達量顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05)(圖2)。

3 轉染后Y79細胞增殖能力的變化 miR-125bmimic組較miR-NC和anti-miR組相比，Y79細胞增殖力顯著提高，差異具有統計學意義(P<0.05)；miR-125binhibitor組較miR-NC和anti-miR組相比，腫瘤細胞增殖力顯著性下降，差異具有統計學意義(P<0.05)(圖3)。

圖1 miR-125b在Y79細胞系中呈高表達

圖2 miR-125b在miR-125bmimic組和miR-125binhibitor組中表達

圖3 miR-125bmimic組和miR-125binhibitor組腫瘤細胞增殖力

4 轉染后Y79細胞凋亡率的變化 miR-125bmimic組較miR-NC和anti-miR組相比，腫瘤細胞凋亡率下降，差異具有統計學意義(P<0.05)；miR-125binhibitor組較miR-NC和anti-miR組相比，Y79 才細胞凋亡率顯著性增高，差異具有統計學意義(P<0.05)(圖4)。

5 miR-125b與靶基因 DRAM2的功能驗證 采用Westernblot檢測miR-NC，miR-125bmimic，anti-miR，miR-125binhibitor四組的靶基因DRAM2蛋白表達量變化。miR-125bmimic組靶基DRAM2表達量下降，miR-125binhibitor組靶基因DRAM2表達量增多，miR-NC，anti-miR組靶基因DRAM2表達量介于上述兩組之間(圖5)。

圖4 四組凋亡實驗流式細胞分布(A)，及量化后各組細胞凋亡比例(B)

討 論

由于我國醫療水平地區差異，醫療資源分配不平衡，使得視網膜母細胞瘤(RB)診斷滯后，很多患兒就醫時不得不行眼球摘除治療。本研究為尋求RB治療新的分子靶點，鑒于miR -125b在很多腫瘤中所發揮的作用為研究背景，探討其在人視網膜母細胞瘤細胞中表達，及其對腫瘤細胞增殖抑制和誘導凋亡的作用。

microRNA是近年來生命科學新的研究熱點之一,其介導轉錄后調控基因表達，從而參與調控細胞增殖、凋亡、腫瘤血管生成、干細胞分化、腫瘤細胞浸潤及轉移等一系列的生命活動。microRNA具備了穩定性好，通過采血即可獲得，可作為視網膜母細胞瘤篩查和診斷的手段之一，還可通過測定其表達量，來評估視網膜母細胞瘤的治療效果。近幾年來，腫瘤相關microRNA 研究層出不窮，證實了很多與腫瘤發生發展、診斷以及預后等具有相關性的microRNA分子[2]。

miR-125b在不同的腫瘤發生和發展中起到了不同作用，有研究指出，miR-125b分子的異常表達在不同腫瘤中的作用不盡相同[3]。Scott GK研究指出在乳腺癌中，MiR-125b分子的表達降低，MiR-125表達增多明顯抑制了乳腺癌細胞的增殖力[4]；而Shi XB在前列腺癌研究中得出，MiR-125b高表達 可以促進腫瘤細胞增殖[5];進一步得出是通過Bak1分子發揮作用；肖文峰對骨肉瘤組織研究發現microRNA-125b的表達水平顯著下降,microRNA-125b過表達可抑制骨肉瘤細胞的增殖,且監測microRNA-125b水平有助于診斷骨肉瘤[6]。王丹丹的研究表明，miR-125b的表達量與肺癌患者化療次數呈反比，提示了miR-125b可作為腫瘤患者評價治療效果的潛在標記物[7]。這些研究結果提示著MiR-125b在不同腫瘤中，表達趨勢和作用的不一致性[8]。

本實驗研究通過miR-125b 的高表達和抑制表達得出miR-125b分子可能作為癌基因參與了視網膜母細胞瘤的發生發展，并且進一步指出其可能是通過DRAM2基因來發揮其致癌作用。DRAM2是DRAM基因(DNA-damageregulatedautophagy modulator)的同源蛋白，DRAM基因是P53介導的細胞自噬死亡的重要組成成分，是P53誘導細胞自噬所需的必須蛋白之一，它通過誘導其他自噬蛋白的累積，而達到細胞自噬的效果[9]。并且研究指出在視網膜母細胞瘤中DRAM2基因表達下降[10]。推測DRAM可通過P53介導的細胞自噬死亡作用，促使腫瘤細胞死亡。我們的研究指出了在Y79細胞中miR-125b高表達，同時伴有DRAM2基因的表達下降，進一步明確了DRAM2基因在RB中所發揮的作用。

本研究結果提示，miR-125b分子的過表達能夠促進視網膜母細胞瘤Y79細胞株的增殖，降低miR-125b分子表達可以抑制Y79細胞增殖，并初步得出其可能是通過DRAM2基因來發揮作用。MiR-125b對腫瘤細胞抑制作用的具體分子機制和分子靶點還需要進一步研究。本文旨在為視網膜母細胞瘤的診斷和治療及預后提供新的思路。

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EffectofmicroRNA-125bonproliferationandapoptosisofhumanretinobcastomacells

Tian Bingyu,Bai Shuwei,Kang Qianyan. Department of Ophthalmology,

The First Affiliate Hospital of Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710061)

Objective ：To evaluate the expression level of microRNA-125b( miR-125b) in retinoblastoma and study its roles in cell proliferation and apoptosis． Methods ：The expression of miR-125b was detected by real-time PCR in retinoblastoma Y79 cell lines．The synthesized miR-125b mimic and miR-125b inhibitor was transfected into retinoblastoma Y79 cell lines．The cell proliferation and apoptosis were measured by CCK-8 and flow cytometry respectively．Results： MiR-125b was significantly up-regulated in retinoblastoma Y79 cell lines .Expression of miR-125b in miR-125bmimic group(Y79 cells+ miR-125bmimic ) was significantly up-regulated compared with miR-NC group(untreated Y79 cells)(P<0.05). It apparently promotes RB cell proliferation and suppresses cell apoptosis in miR-125bmimic group compared with miR-NC group (P<0.05),while it apparently suppresses RB cell proliferation and promotes cell apoptosis in miR-125bmimic group compared with miR-NC group (P<0.05) . the suppressor gene DRAM2 may be identified as direct target of miR-125b.Conclusions ：MiR-125b may act as an oncogene in retinoblastoma through regulation of cell proliferation and apoptosis．

@microRNA-125b Rretinoblastoma/pathology Cell proliferation Apoptosis Oncogenes

*國家自然科學基金資助項目(81302198)

△通訊作者

@microRNA -125b 視網膜母細胞瘤/病理學 細胞增殖 細胞凋亡 癌基因

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.11.001

(收稿：2017-05-18)