全仿生多層復合組織工程支架系統構建研究*

李征宇,姬 鋼△,嚴少榮,賈帥軍,仉培武,郭 健,段春光,董 鑫

1.西安市中心醫院(西安710004),2.西安市紅會醫院(西安710054)，3.第四軍醫大學附屬西京骨科醫院(西安710032)

全仿生多層復合組織工程支架系統構建研究*

李征宇1,姬 鋼1△,嚴少榮1,賈帥軍2,仉培武1,郭 健1,段春光3,董 鑫3

1.西安市中心醫院(西安710004),2.西安市紅會醫院(西安710054)，3.第四軍醫大學附屬西京骨科醫院(西安710032)

目的：通過先進的3D打印技術設計并制作一種新型全仿生多層復合支架組織工程支架，完全模擬生理狀態下的關節骨-軟骨結構，以期為修復骨-軟骨全層缺損提供一種新的方法。方法：設計完全模擬生理狀態下骨-軟骨結構，采用3D生物打印技術和改進的溫度梯度熱誘導相分離技術(TIPS)設計一種全仿生多層復合支架。通過使用電子顯微鏡(SEM),免疫熒光染色和顯微CT等方法，對新型多層支架結構進行細致觀察，評估支架仿生性和微觀結構。同時對支架進行生物力學檢測，評估其力學性能。結果：電子顯微鏡(SEM),免疫熒光染色和顯微CT觀察顯示，軟骨層支架的表面及內部結構規則，骨支架包含十字交叉結構,擁有較高的孔隙率。鈣化層結構致密，可以起到良好的隔離作用，與生理狀態下的關節骨-軟骨結構完全類似。經生物力學性能測試顯示,支架的最大抗拉強度和最大抗剪強度明顯高于傳統支架。結論：所構建復合多層組織工程支架結構規則，孔隙率高，具有較高的生物力學性能，完全與生理狀態下的關節骨-軟骨結構一致，可以作為修復關節全層損傷的潛在新方法。

全仿生的關節骨-軟骨組織工程支架：包括上層的柱狀軟骨層、中層的軟骨鈣化層和下層的骨支架層。與傳統支架相比，新型支架加入了定向軟骨層和軟骨鈣化層,不僅可以模擬正常的軟骨結構，同時具有增加力學強度和良好的組織微環境隔離功能。上層的定向軟骨層區域含有II型膠原蛋白，和軟骨細胞外基質相同，可以促進軟骨細胞生長。中間的鈣化層和下方的骨支架層通過3D打印技術，由羥基磷灰石(HA)和PLGA制成，可以增加支架整體的力學性能。本實驗通過檢測新型全層仿生支架的微觀結構和生物力學性能和孔隙率，分析不同的支架區域的仿生精確性，比較其與傳統支架的優勢，獲得新型支架的基本數據信息。以期探索一種具有較高的生物力學性能，完全與生理狀態下的關節骨-軟骨結構一致，且可以作為修復關節全層損傷的新型全仿生多層復合組織工程支架系統的制作方案。

材料與方法

1 支架制作過程

1.1 定向軟骨層支架的制作：在無菌條件下，選取新鮮小牛的四肢，解剖并尋找牛膝關節軟骨，將軟骨從關節面仔細削割下來，再通過脫細胞技術和冷凍干燥后得到海綿狀基質。獲得的軟骨基質后，用去離子水配成2%的基質溶液，放入離心機離心(700r/min)清除氣泡。將無氣泡基質溶液倒入模具中(直徑10mm，高度8mm)。模具孔上方開口，下方由金屬底座封底，周圍用保溫棉纏繞。靜置其于載物臺上，待其與室溫平衡，將模具金屬底部浸入液氮(-196°C)中放置4h，此時模具有底部向頂端已經形成自下而上的溫度梯度差，溫度梯度差將軟骨基質溶液凝固成沿著梯度方向的縱行定向結構。將整個模具放入-30°C冰箱內24h，使支架徹底凍結，最后放入冷凍干燥機中凍干12 h后取出，得到具有定向結構的軟骨支架。

1.2 骨支架的制作：首先用計算機特定軟件設計出實驗所需要的含有鈣化層和無鈣化層骨支架的電子模型，之后用1,4-二氧六環溶解固態PLGA，將其配置成3%PGLA的溶液，在配好的溶液中再加入1%TCP粉末，放在磁力攪拌器上，配制成懸濁液。待攪拌均勻后，立即放入生物3D打印機中，按照預先設計好的電子模型打印出需要的骨支架。最后骨支架放入冷凍干燥機內凍干12h，得到所需的含有鈣化層和無鈣化層的兩種骨支架。

1.3 復合多層支架的制作：采用新技術“溶解-連接”法來完成新型支架軟骨部分和骨部分的緊密連接。使用新設計的專利噴頭將1,4-二氧六環微細液均勻的噴涂到不含有鈣化層的骨支架和含有鈣化層的骨支架頂部和軟骨支架底部表面。1,4-二氧六環液體接觸到支架后會使其表面微微溶解，形成液態層，在液態層沒有干燥之前，迅速將噴涂的兩個表面緊密貼合在一起，然后靜置于載物臺上30min，待其完全干燥后，將支架放入冰箱(-30℃)內冷凍24h，保證接觸面完全凍結，之后放入凍干機中凍干12h取出，獲得完整復合多層支架。

2 支架特征描述

2.1 實體顯微鏡檢測：使用實體顯微鏡觀察新型復合支架的整體結構。將支架樣本分別放入實體顯微鏡視野內，調整顯微鏡攝像頭和焦距，并用配套計算機軟件采集和分析圖像。通過這種方法，可以細致觀察新型支架的大體結構。

2.2 免疫熒光檢測：在對支架進行熒光免疫檢測之前，將選取的樣本使用4%的戊二醛在20℃的溫度下浸泡約20min，使用無菌PBS液反復沖洗3遍，將表面水跡吸干后放在蓋玻片上，使用激光共聚焦顯微鏡觀察(Leica TCS SP2,Germany)，圖像采集和分析系統使用DP-Controller system系統(OLYMPUS,Japan)和Image-pro Plus 5.0 software (Media Cybernetics,USA)軟件進行處理。

2.3 電子顯微鏡檢測：選取的支架樣本首先在真空干燥器中干燥約12h，充分脫水后，將支架表面均勻噴涂鈀金，放入電子顯微鏡中觀察。所有的實驗數字圖像均由電子顯微鏡( JEOL 840 73,Joel,Japan) 獲得，支架的結構和孔徑分析均由其自帶軟件完成。

2.4 Micro-CT 檢測：使用Micro-CT觀察新型多層復合支架的整體結構。每組取5個支架作為檢測樣本，將其放入Micro-CT scan掃描儀中，樣本掃描的精度定為50 μm，圖像分析使用Microview v1.1.1 software軟件完成。以樣本的中心為原點，取直徑為6mm，高度為7mm的圓柱形區域作為感興趣區。重建該區域的三維圖像并進行分析。

2.5 孔隙率：對支架進行冷凍干燥處理后，對整體支架的相對密度進行檢測。使用排水法來檢測支架的孔隙率，將支架的質量記為W0，裝滿乙醇稱量瓶的質量記為W1，將整個支架放入稱量瓶且沒入其中，然后用真空吸引器抽出其中殘留的空氣，直至沒有多余氣泡被抽出，測量此時的稱重瓶質量記為W2，稱重瓶本身的質量記為W3，最后將支架取出。設定室溫下乙醇密度為ρ。經計算可知：支架整體固體所占的體積為：Vo=(W1-W2+Wo)/ρ，支架整體孔隙所占的體積為：Vs=(W2-W3-Wo)/ρ，整體支架的孔隙率(ε)依靠下列公式獲得：ε = [Vs/(Vs+Vo)]×100%。在實驗中，實驗組和對照組分別選取5個支架進行檢測，結果用均數±標準差的方式進行描述。

2.6 生物力學檢測：檢測兩種支架的最大剪切強度和最大抗張強度。首先使用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA) 噴涂在檢測探頭末端以及準備檢測支架的末端，使得兩者緊緊連接在一起，保證在使用生物力學檢測儀器時，當作用力強度較大時兩者不會分離。在此項檢測中，將儀器的拉伸速度設定為1.0mm/min，之后使用最大剪切力或最大拉伸力(F)除以兩種支架的截面積(A) 來計算最大剪切強度和最大拉伸強度(P=F/A)。每組支架均選取5個樣本進行單獨檢測，結果使用均數±標準差來進行描述。

3 統計學方法 選用SPSS 20.0統計學軟件。采用均數±標準差的形式進行描述。在比較兩組支架之間的區別時，采用兩樣本t檢驗進行分析。在比較三組或三組以上不同支架時，采用one-way ANOVA法進行分析。P< 0.05時有統計學意義。

結 果

1 實體顯微鏡觀察 實驗組復合支架含有很厚的鈣化層，而對照組則不含有軟骨鈣化層。經過觀測可以確定，兩組復合支架均完全符合設計要求，而且實驗組復合支架具有非常明顯的鈣化層結構。

2 免疫熒光觀察 使用激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP2,Germany)對支架進行觀察后，發現支架的軟骨層和骨支架層均具有自發熒光。通常自然狀態下的生物型材料在受到熒光激發時，都會產生較弱的熒光反應，新型多層復合支架也采用II型膠原蛋白、PLGA、HA，這些材料都是生物型材料，在人體內廣泛存在，所以都會在熒光激發的條件下，產生熒光反應。經觀察后發現，軟骨支架材料和骨支架材料在使用紅光激發時，均可以產生紅色熒光，證明支架本身生物性能較高。軟骨支架呈縱行結構，且結構清晰，內部和外部分布均勻。骨支架同樣有自發熒光，呈十字交叉形狀，形狀規則，結構穩定(圖1)。

3 電子顯微鏡觀察 兩組支架的細微結構具有明顯的區別：實驗組具有厚實的鈣化層結構，而對照組則不具有鈣化層結構。鈣化層的微觀結構致密，內部無空隙。兩組軟骨支架均具有良好的縱行定向結構，且定向結構完整，相鄰定向結構的間距約為30μm。骨支架具有完整的交叉十字型框架結構，相鄰框架的見距約為400 ～500μm。骨支架交叉十字框架型結構的內部富含細小的微孔結構。

4 Micro-CT觀察 軟骨支架縱行定向結構明顯，且不僅存在于表面并穩定存在于支架內部。鈣化層結構具有極高的密度，其可以將骨和軟骨生長微環境分隔開來。經檢測整體支架的直徑為6mm，總高度為7.5mm，其中軟骨層支架厚度2mm，骨支架厚度5mm，鈣化層厚度為0.5mm。軟骨支架層和骨支架層緊密結合在一起。軟骨支架由縱行定向結構構成，縱行定向結構之間距離約為(30.2±5.3)μm。在縱行定向結構之間存在極小的微孔，微孔有助于細胞生長過程中營養物質的流動和交換。骨支架為格子狀框架，彼此交叉。此結構可以提供較好的生物力學特性。骨支架彼此交叉框架之間的距離為400μm。在骨支架交叉框架結構內部，存在著很多微孔，有的彼此獨立，有的相互連接。軟骨支架與骨支架在結構上存在較大差異，并且各自孔徑和微結構都存在諸多不同(圖2)。

5 孔隙率 通過應用排水法來檢測兩種不同支架的孔隙率后發現：含有鈣化層的整體支架平均孔隙率是(85.2±2.8)%，不含有鈣化層的整體支架平均孔隙率是(83.7±3.4)%。經統計學分析，兩組不同支架的孔隙率比較無統計學差異(P> 0.05)。

6 生物力學檢測 含有鈣化層支架的最大抗張強度是(89.2±16.4)kPa，不含有鈣化層支架的最大抗張強度為(51.8±11.4)kPa。證明含有鈣化層支架的最大抗張強度是不含有鈣化層支架的1.9倍。經檢測含有鈣化層支架的最大剪切強度是(109.7±12.3)kPa，而不含有鈣化層支架最大剪切強度是(51.8±11.4)kPa。證明含有鈣化層支架的最大剪切強度是不含有鈣化層支架的2.1倍。經統計學分析，兩組支架之間的最大抗張強度與最大剪切強度比較具有統計學差異(P< 0.05)，含有鈣化層支架的最大抗張強度和最大剪切強度都明顯高于不含有鈣化層支架，具有更高的生物力學性能(圖3)。

a,d為縱行定向軟骨支架圖像;b,e為交叉框架結構骨支架圖像;c,f為軟骨鈣化層圖像

a:兩組支架最大抗張強度的比較;b:兩組支架最大剪切強度的比較

討 論

臨床上經常有嚴重創傷，腫瘤等多種因素導致的關節骨軟骨全層損傷，由于軟骨組織缺乏血液循環和淋巴回流，關節軟骨細胞為終末分化細胞，再生能力非常低，這些原因使得關節軟骨損傷修復難度很大。所以患者預后很差，經手術治療后仍發生殘疾和畸形，甚至喪失運動能力。透明軟骨發生病變會引起長期且持久的疼痛，以至許多患者通常需要關節置換。盡管自體骨-軟骨移植現在被認為是臨床治療的金標準,但這種治療技術有很多局限性如：自體材料的有限,匹配形狀不吻合以及對周圍健康組織的影響[1-2]。骨-軟骨的組織工程支架的制作難點在于完全模擬生理狀態的關節組織結構。理想的生物材料需要良好的生物相容性、可控的材料降解率、良好的可望性和一定的生物力學特性，同時不僅要能維持細胞的形態和表型，而且能促進細胞粘附和增殖，誘導組織再生[3]。關節軟骨是一種高度組織性的結構，軟骨面光滑平整，提供了耐磨損的表面且各方向的力學性能都達到充分平衡。軟骨柱狀層則可以向下均勻傳導力學，因此,關節軟骨可以在承載很大負荷的情況下仍然不會發生破裂。關節軟骨的兩個主要功能區域為:軟骨柱狀區和軟骨鈣化層[4-5]。

隨著3D打印技術的發展，為關節骨-軟骨治療提供了新的可行性，相比與傳統的治療方法具有顯著的優勢。首先，可以保證材料供給的充分，可以讓支架的形狀與受體缺損的部位完全匹配，并且可以按照個性化要求進行制作，而且采用生物相容性高的材料進行支架制作，可以將移植物對組織的影響降到最低。通常使用的生物材料包括聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙醇酸(PGA),聚乳酸(PLA)、羥基磷灰石(HA)和磷酸三鈣(TCP)[6-7]。還包括天然材料如：透明質酸、瓊脂糖、I型膠原蛋白、II型膠原、纖維蛋白等[8]。其中II型膠原蛋白、PLGA、HA都是美國FDA認證的生物材料，其具有良好的生物學特性，廣泛的應用于支架材料的制作中，可以促進細胞的粘附和增殖。

理想的組織工程支架，可以完全模擬生理狀態下關節的正常結構，同時具有較好的生物力學強度。正常關節全層的生理結構包含有定向軟骨層、軟骨鈣化層和骨組織層。國內外對于關節的組織工程支架有很多報道，但是對于完全模擬關節全層仿生組織工程支架目前還沒有報道，對工藝要求較高，在組織工程領域的研究難度較大。本課題組利用先進的3D生物打印技術和改進的“TIPS” 低溫冷凍成形術設計并制作了新型多層復合組織工程支架，同時設計加入軟骨鈣化層，雖然只是很薄的致密骨組織結構，但其密度很高，具有很大的生物力學強度，在整個關節結構中發揮著極其重要的作用。

本實驗采用HA和PLGA作為制作軟骨鈣化層的材料，主要是因為這兩種材料已經被美國FDA認證，具有良好的生物相容性和較小的副作用，同時其具有良好的成型特性和較高的生物力學性能等優點[9]。實驗結果也充分證明，軟骨鈣化層擁有極高的生物力學性能，課題試驗組支架最大剪切強度為對照組的2.1倍，說明增加鈣化層后可以明顯提高支架整體的生物力學性能。這種新型的復合支架的力學性能與比傳統支架相比要高很多，其原因可能與本實驗使用的新型連接工藝有關。通常傳統支架各層次的連接方式主要有纖維蛋白膠粘合或者絲線縫合法，這些方法連接不牢固，都不能使支架各層緊密連接在一起[10]。新型的 “溶解-連接”工藝可以將軟骨支架與骨支架緊密連接起來，而且在使用電鏡檢測后發現，連接處緊密無孔隙，內部致密無孔洞，充分保證其可以擁有較高的力學性能。軟骨鈣化層除了增加整體支架的生物力學性能之外，還可以起到較好的隔離作用，在關節全層修復過程中，可以有效的隔離骨細胞微環境及軟骨細胞微環境，使各自細胞在不同的微環境中生長不受干擾。

然而由于本實驗樣本數量的限制，可能存在一些統計偏差，在今后的研究中會增加更多的樣本數量來提高實驗的精確性。鈣化層可以具有較高的密度和很好的隔離效果，可以有效的隔離骨細胞和軟骨細胞生長的微環境，但是對骨細胞和軟骨細胞的具體影響還不清楚，在今后的實驗中需要進一步探討。

總之，新型多層復合組織工程支架中具有極高的仿生性，較高的孔隙率，較高的生物力學性能，同時具有高效、穩定、成熟的制作工藝和成型結構，可以作為修復關節全層損傷的新方法。

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Theresearchofbuildingthebionicmultilayercompositetissueengineeringscaffoldsystem

Li Zhengyu,Ji Gang,Yan Shaorong,et al.

Department of Orthopaedics,Xi’an Central Hospital (Xi’an 710004 )

Objective: Use 3D printing technology to design and making a new type of tissue engineering scaffolds which have bionic multilayer structures. This kinds of scaffolds can mimic bone and cartilage structures of physiological joints in order to provide a new way to repair bone and cartilage full-thickness defects. Methods: Tissue engineering technology can be used as a potential method to treat full-thickness of joint damage. This study designed a new kind of scaffolds to mimic the structure of bone and cartilage. We used 3D printing technology to design and make bone scaffolds and used TIPS technology to design and make cartilage scaffolds. By using electron microscope (SEM),immunofluorescence staining,Micro- CT and other methods,we observed the microstructures of new scaffolds. By using biomechanical tests,we assessed the biomechanical performance of scaffolds. Results: After observing by immunofluorescence staining,SEM,and Micro-CT,we found that cartilage layer scaffolds had regularly oriented microtubules and bone layer scaffolds had regularly cross frame structures. Both of them had higher porosity. The structures of calcified layer had excellent isolation effects and were completely similar to the normal articular structures. After biomechanical performance test,we found that both of the maximum tensile strength and the maximum shear strength of the new scaffolds were higher than traditional scaffolds. Conclusion: This kind of composite multi-layer tissue engineering scaffolds have higher porosity,regularly cross frame structures and better biomechanical properties. It can mimic the normal articular structures and can be used as a potential method to treat full-thickness of joint damage.

Tissue engineering Biomimetic materials Printing,three,dimensional Brales Joint prosthesis

*陜西省社會發展科技攻關項目(2015SF170)

△通訊作者

組織工程 生物仿生材料 打印，三維 支架 人工關節

R35

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.11.004

(收稿：2017-04-24)