MKP1對他莫昔芬耐藥MCF7細胞耐藥性的影響研究*

白靜靜,馬 剛△,何建軍,潘怡霞

1.陜西省人民醫院(西安 710068)，2.西安交通大學醫學部(西安 710061)

MKP1對他莫昔芬耐藥MCF7細胞耐藥性的影響研究*

白靜靜1,馬 剛1△,何建軍2,潘怡霞2

1.陜西省人民醫院(西安 710068)，2.西安交通大學醫學部(西安 710061)

目的：研究MKP1對他莫昔芬耐藥MCF7細胞耐藥性的影響及其分子機制。方法：應用Real-time PCR和Western blot 分析MKP1在MCF7和他莫昔芬耐藥MCF7細胞中的表達變化；Western blot 分析MKP1 siRNA在他莫昔芬耐藥MCF7細胞中對他莫昔芬誘導MAPK成員活化的影響；MTT比色法分析細胞活力；流式細胞儀分析細胞凋亡；SP600125抑制JNK活化。結果：與MCF7細胞相比，MKP1在他莫昔芬耐藥MCF7細胞中表達上調；MKP1 siRNA可增加他莫昔芬對耐藥MCF7細胞活力的抑制作用；MKP1 siRNA組與對照組相比，他莫昔芬介導的耐藥MCF7細胞的凋亡顯著增加；siRNA組與對照組相比，他莫昔芬誘導的JNK活化顯著增強；SP600125抑制JNK活化后，MKP1 siRNA 組他莫昔芬耐藥MCF7對他莫昔芬的耐藥性部分恢復。結論：MKP1通過抑制他莫昔芬誘導的JNK活化維持MCF7他莫昔芬耐藥細胞對他莫昔芬的耐藥性。

乳腺癌是女性發病率最高的惡性腫瘤，近年來發病率逐漸上升，且有年輕化趨勢[1]。乳腺癌可分為三種基本類型：ER陽性型，Her2基因擴增型和三陰性型，其中ER陽性型乳腺癌約占總乳腺癌發病率的70%以上[2]。他莫昔芬是治療ER陽性型乳腺癌的經典藥物，但ER陽性乳腺癌對他莫昔芬的耐藥限制了其應用。已有研究顯示，他莫昔芬耐藥機制復雜多變[3]。因此，從分子水平探尋他莫昔芬耐藥機制，篩選新的分子指標，為其耐藥的ER陽性乳腺癌提供新的分子治療靶標，仍是目前乳腺癌研究的熱點之一。

MKP1是絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶家族(Mitogen-activated protein kinase phosphatase family,MKPs)成員。MKPs可將MAPKs共有模體TXY中的磷酸化酪氨酸和色/蘇氨酸殘基去磷酸化，從而負性調節 MAPKs信號[4]。包括MKP1在內的多個MKPs成員在腫瘤中存在表達異常，且與腫瘤的發生發展密切相關。已有研究表明，MAPKs及其下游信號通路參與誘導ER陽性乳腺癌細胞產生他莫昔芬耐藥[5]。而作為MAPKs的負性調節因子，MKP1在他莫昔芬耐藥機制中的作用尚未有人闡明。本研究發現MKP1在他莫昔芬耐藥MCF7細胞中表達增高；利用siRNA沉默MKP1基因表達，分析MKP1對他莫昔芬耐藥性的影響；觀察MKP1沉默后，他莫昔芬作用下MAPKs活化水平的變化，探討MKP1參與MCF7細胞他莫昔芬耐藥的分子機制。

材料與方法

1 材 料 人乳腺癌MCF7細胞系購自中科院上海細胞庫，他莫昔芬耐藥的MCF7細胞系由北京中醫藥大學的陳信義教授惠贈[6]。無酚紅的DMEM培養基及活性炭處理過的胎牛血清購自PAA。4-hydroxy tamoxifen(TAM，H7904)，SP600125購自Sigma；逆轉錄及實時定量PCR試劑盒購自TAKARA； 轉染試劑TurboFect購自Fermentas；MKP1 siRNA pool(UGGAGCAUAUCGUGCCGAA；AAGAUAUGCUCGACGCCUU)， Scrambled siRNA(CGTACGCGGAATACTTCGA)購自Dharmacon；MKP-1(sc-370)多克隆抗體購自Santa Cruz；兔抗人MAPKs，p-MAPKs，p-c-jun，PARP單抗，均購自CST； CCK-8試劑盒購自同仁研究所；細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基；BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo。

2 細胞培養 MCF7 細胞培養于含胎牛血清100ml/L，青霉素100 U/ml，鏈霉素100μg/ml的DMEM培養基中。他莫昔芬耐藥的MCF7細胞(MCF7-TR)在含5μmol/L TAM(溶媒為DMSO)的培養基中維持培養8月。所有細胞置于37℃、50ml/L CO2及飽和濕度條件下長期培養,2～3d 換液，細胞融合至 80%～90%時傳代。

3 MTT吸光度實驗 收集對數生長期細胞，調整細胞密度為1×104/ml，接種于 96 孔板內，200μl/孔，置于37℃、50ml/L CO2培養箱內，孵育過夜后更換培養基。實驗組加入藥物，每個藥物濃度設 6 個復孔；溶媒對照組加入含等體積溶媒的培養基；以無血清培養液作空白調零。細胞活力檢測：將細胞培養48h后，每孔加入含有10ml/L CCK-8的培養液100μl，繼續培養2h后酶標儀檢測450nm波長處各孔吸光度(OD)值。細胞活力(%)=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。生長曲線：各組細胞平行培養 1、3、5、7d后，如上法檢測450nm波長處各孔吸光度(OD)值，繪制細胞生長曲線。

4 Annexin-PI染色檢測細胞凋亡 取對數生長期細胞以細胞數2×106個/孔接種于6cm培養皿中，培養24h后加入TAM使終濃度分別為0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L。繼續培養48h后胰酶消化為單細胞懸液，置入10ml離心管，預冷PBS洗滌2次，1000r/min離心5min收集細胞。棄上清，加入500μl Binding Buffe→5μl Annexin V-FITC→5 μl Propidium Iodide。室溫避光反應5～15min，進行流式細胞檢測。

5 MKP1 siRNA瞬時轉染細胞 按照TurboFect轉染說明書，MCF7-TR細胞用無抗生素含活性炭濾過胎牛血清的無酚紅DMEM培養液重懸，調整細胞密度，接種于96或6孔板中，于37℃培養箱中貼壁培養過夜后，將MKP1 siRNA pool和Scrambled siRNA瞬時轉染MCF7-TR 細胞，6h后更換培養基，繼續培養48h后備用。

6 Real-time PCR檢測MKP1 mRNA表達 Trizol 法提取總RNA,取總RNA 1.0μg利用TaKaRa 逆轉錄試劑盒進行反轉錄。設計人MKP1 序列實時定量PCR引物，MKP1引物：上游5’-GGGACGCGCGGTGAAG-3’，下游5'-GATCTTGTGCGGTTTTTTGTGG-3’；18S引物，上游5’-TCTCAAAGATTCGCCATG-3’，下游5’-TCACCAACGGAGACCTT-3’。實時定量擴增條件：94℃ 90s；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃60s，30個循環；60℃延伸5min。2-ΔΔCt法對實時定量PCR結果進行相對定量統計。

7 Western blot 細胞由RIPA裂解液冰上裂解。離心去除沉淀，加5×SDS Loading Buffer后100℃水浴5min。各取等量蛋白在100g/L的SDS-PAGE 膠上電泳，半干法轉印至PVDF膜，用含50g/L BSA的PBST室溫封閉 1 h，一抗4℃孵育過夜后PBST洗膜，二抗室溫孵育 1 h，PBST 洗膜。加入發光劑，于ChemiDocTM MP成像系統檢測并拍照。應用該系統自帶的條帶分析軟件計算條帶積分吸光度值并進行半定量分析。

結 果

1 MKP1在他莫昔芬敏感和耐藥的MCF7細胞系中的表達 比較MCF7 和MCF7-TR細胞經TAM處理后的生長曲線，提示MCF7-TR細胞對TAM耐藥(t3d=-16.817，P3d<0.01；t5d=-31.224，P5d<0.01；t7d=-56.764，P7d<0.01)(圖1A)。與MCF7細胞相比，MCF7-TR中MKP1 mRNA 表達顯著上調(t=-9.196，P<0.01)(圖1B)；MKP1蛋白表達也明顯升高(圖1C)。

2 MKP1敲低對MCF7-TR細胞他莫昔芬敏感性的影響 利用MKP1 siRNA轉染MCF7-TR細胞后，Western blot 檢測MKP1敲低水平(圖2A)。MTT法檢測不同濃度TAM(5μmol/L,10μmol/L)處理48h后，MKP1敲低組和對照組MCF7-TR細胞的存活率(圖2B)。結果顯示在5μmol/L、10μmol/L TAM濃度組別中，MKP1敲低組MCF7-TR細胞存活率均較對照組顯著降低(F1=40.908，P1<0.01；F2=58.153，P2<0.01)。說明MKP1改變能影響MCF7-TR細胞的TAM敏感性。

A ：TAM作用下MCF7-TR細胞的生長曲線,與MCF7細胞比較，*P3d<0.01；★P5d<0.01； #P7d<0.01；B：MCF7-TR細胞中MKP1 mRNA表達，與MCF7細胞比較，*P<0.01；C：Western blot結果，E2，E2 50nmol/L組；TAM，TAM 5 μmol/L組

圖1 MKP1在人乳腺癌MC7和MCF7-TR細胞中的表達

與對照組比較，*P1<0.01， ** P2<0.01

3 MKP1敲低對他莫昔芬誘導MCF7-TR細胞凋亡的影響 應用不同濃度TAM處理MKP1 siRNA轉染組與對照組MCF7-TR細胞48h后，采用 Annexin V+PI試劑盒在流式細胞儀上檢測細胞凋亡(圖3)。結果顯示，與對照組細胞相比，TAM 誘導MKP1敲低組細胞發生凋亡的比例顯著增加(t1=-6.789，P1<0.01；t2=-9.611，P2<0.01)(圖4)。

4 MKP1敲低可增加TAM誘導的JNK活化 因MKP1可抑制MAPKs成員的磷酸化，所以我們利用Western blot檢測了MKP1 siRNA轉染組與對照組MCF7-TR細胞在不同濃度TAM處理24h和48h后，其MAPKs的磷酸化水平。結果顯示，敲低MKP1后，TAM誘導MAPKs活化增加，其中JNK活化增加尤其顯著(圖5)。

A:流式細胞術鑒定各組MCF7-TR細胞經TAM處理后凋亡； B:各組細胞凋亡率比較，*P1<0.01， ** P2<0.01

圖3 TAM誘導各組MCF7-TR細胞凋亡比較

5 MKP1通過調節JNK活性保護細胞 為明確JNK活化是否與MKP1敲低的MCF7-TR細胞對TAM敏感性恢復相關，我們在用TAM處理細胞之前，用JNK特異性抑制劑SP600125預處理細胞3h。結果顯示SP600125顯著降低MKP1 siRNA轉染的MCF7-TR細胞的JNK信號通路的激活(圖6)；也顯著減少了TAM誘導的細胞凋亡(t=4.902，P<0.01)(圖6)。

圖4 各組細胞凋亡比較

A: Scrambled siRNA轉染的MCF7-TR細胞，蛋白上樣量50μg，15s；B: MKP1 siRNA轉染的MCF7-TR細胞，蛋白上樣量50μg

圖5 Western blot 檢測 TAM誘導各組MCF7-TR細胞p-MAPKs 表達

討 論

MAPKs信號通路是調節哺乳動物細胞生長和死亡的重要信號通路，有多種機制參與其活性的調控，MKPs即是此通路重要的負性調節因子[4]。MAPKs信號通路的失調與多種疾病相關，特別是在腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用。累積的研究提示，MKPs與MAPKs信號失調相關，且其多個成員能夠通過對MAPKs信號的調節參與腫瘤的發生和發展[7]。

A:各組細胞JNK通路活性及cleaved-PARP表達；B:JNK抑制劑處理后TAM誘導各組細胞凋亡比較，*P<0.01

圖6 JNK抑制劑對TAM誘導各組MCF7-TR細胞凋亡的影響

MKP-1是研究最多的MKP家族成員，其與腫瘤的相關性研究也最為深入。MKP-1在多種腫瘤中表達改變[8]。研究報道MKP1在早期前列腺癌、結腸癌和膀胱癌中呈過表達；但隨著腫瘤分級增高和出現轉移，MKP1的表達呈進行性丟失。在肝細胞肝癌、卵巢癌中，MKP1在腫瘤細胞中的表達較正常細胞明顯下調。而在乳腺癌、非小細胞肺癌和胰腺癌中，MKP1表達則明顯上調。本研究亦顯示，與母代MCF7細胞相比，他莫昔芬耐藥的MCF7細胞中MKP1的表達上調。由此可見，MKP1參與腫瘤發生發展的機制復雜。在不同腫瘤中或腫瘤發展的不同階段，MKP1往往顯示出特異性的作用。

MKP-1與腫瘤耐藥的相關性研究的最多。最早的證據源于對順鉑耐藥的研究。順鉑殺傷腫瘤細胞的機制之一是誘導JNK介導的凋亡通路活化。而MKP-1卻能對JNK實施去磷酸化從而抑制JNK的活性，最終導致順鉑耐藥。當利用siRNA敲低MKP-1表達后，順鉑誘導的細胞凋亡會明顯增加[9]。MKP-1也與其他抗腫瘤藥物的耐藥相關。有研究顯示，MKP-1在乳腺癌中的過表達能夠保護腫瘤細胞免于遭受多種化療藥物如多柔比星，氮芥和紫杉醇類誘導的細胞凋亡[10]。最近的一項臨床研究更顯示， MKP-1過表達可能與靶向藥物西妥昔單抗耐藥相關[11]。本研究中，采用RNA干擾技術對MKP1進行基因沉默后，他莫昔芬作用下的MCF7-TR細胞活力減低，凋亡增加，部分恢復了對他莫昔芬的敏感性，提示MKP1參與維持MCF7-TR細胞的他莫昔芬耐藥性。

他莫昔芬聯合同步放化療可有效減輕放化療引起的骨髓抑制、消化道反應、放射性損傷等毒副反應[12]；同時，其聯合乳癖消、散瘀化瘀方治療乳腺增生可取得較好的療效[13-14]。作為經典的雌激素受體調節劑，他莫昔芬主要通過與雌激素競爭性結合雌激素受體并抑制其活化，從而下調雌激素受體信號通路活性，達到抑制細胞增殖的作用[15]。研究亦報道，他莫昔芬也可激活JNK等信號通路，從而抑制乳腺癌細胞增殖，誘導細胞凋亡[16]。導致他莫昔芬耐藥的機制復雜，因素多變。主要機制可能為雌激素受體信號通路與活化的激酶信號通路之間形成串話調節，導致雌激素受體非配體性激活，引起下游通路活化增加。另外雌激素受體缺失、核受體共調節因子失衡、表皮生長因子受體信號通路過度活化等均可導致他莫昔芬耐藥[17]。本研究利用siRNA敲低MKP1后，他莫昔芬明顯促進MCF7-TR細胞JNK的磷酸化，顯示在MCF7-TR細胞中，MKP1主要對JNK實施去磷酸化，從而抑制JNK活性。在應用JNK特異性抑制劑SP600125預處理細胞后，他莫昔芬誘導MKP1敲低MCF7-TR細胞凋亡的能力降低。提示MKP1能通過抑制JNK活性維持MCF7-TR對他莫昔芬的耐受性。

總之，MKP1在他莫昔芬耐藥的MCF7細胞中表達上調，并可抑制他莫昔芬介導的JNK凋亡通路活化，從而維持細胞對他莫昔芬的耐藥。但是，他莫昔芬耐藥MCF7細胞中上游信號如何調節MKP1表達，其他MKPs家族成員是否也參與維持他莫昔芬耐藥性，尚需進一步研究。

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EffectsofMKP1onthedrugsensitivityoftamoxifenresistantMCF7cells

Bai Jingjing,Ma Gang,He Jianjun,et al.

Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an 710068)

Objective：To investigate the effects of mitogen-activated protein kinase phosphatase 1(MKP-1) on the drug sensitivity of tamoxifen resistance breast cancer MCF7 cells and the molecular mechanisms. Methods：The expression of MKP1 in MCF7 and tamoxifen resistant MCF7 cells were analyzed by Real-time PCR and Western Blot. Effects of MKP1 siRNA on the activation of MAPKs mediated by tamoxifen in tamoxifen resistant MCF7 cells were analyzed by Western Blot. MTT assy was used to analyze the effects of MKP1 siRNA on survival rate of tamoxifen resistant MCF7 cells after tamxoifen treatment. The effects of MKP1 siRNA on apoptosis induced by tamoxifen in tamoxifen resistant MCF7 cells were analyzed with flow cytometer. JNK inhibitor SP600125 was used to treat MKP1 siRNA group cells. Results：MKP1 expression level was higher in tamoxifen resistant MCF7 cells compared with parental MCF7 cells. MKP1 siRNA enhanced the tamoxifen sensitivity of tamoxifen resistant MCF7 cells,and promoted the apoptosis induced by tamoxifen. Tamoxifen-induced activation of JNK significantly increased in MKP1 siRNA group tamoxifen resistant MCF7 cells compared with control group cells. SP600125 recovered tamoxifen resistant capacity in MKP1 siRNA group tamoxifen resistant MCF7 cells. Conclusion：MKP1 maintains tamoxifen resistant capacity in tamoxifen reisistant MCF7 cells through blocking JNK activation.

Drug tolerance Mitogen-activated protein kinase phosphatase Tamoxifen @MCF7 cells Apoptosis

*陜西省科技攻關項目(2011K13-01-08)

△通訊作者

藥物耐受性 絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶 他莫昔芬 @MCF7 細胞凋亡

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.11.006

(收稿：2017-05-04)