MMP-2在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義*

王光輝，王虎霞，陳 楠，盛 薇

1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 (西安 710061)，2. 陜西省腫瘤醫(yī)院乳腺中心(西安 710061)

MMP-2在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義*

王光輝1，王虎霞2，陳 楠2，盛 薇1

1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 (西安 710061)，2. 陜西省腫瘤醫(yī)院乳腺中心(西安 710061)

目的:探討明膠酶A(MMP-2)在乳腺正常組織、不典型增生、原位癌、浸潤性癌組織中的表達(dá)水平，分析其與浸潤性乳腺癌臨床相關(guān)病理指標(biāo)及術(shù)后生存情況的相關(guān)性。方法:收集正常乳腺組織20例、不典型增生28例、導(dǎo)管內(nèi)癌40例、浸潤性乳腺癌標(biāo)本80例，用免疫組化SP法檢測各組MMP-2的表達(dá)，分析其在浸潤性乳腺癌中的表達(dá)水平與腫瘤大小、腋窩淋巴結(jié)受累情況、TNM分期、組織學(xué)分級、ER、PR、HER-2等臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性；并分析其對乳腺癌患者術(shù)后生存狀況的影響。結(jié)果：MMP-2在乳腺正常組織(陽性率20.0%)、乳腺不典型增生組織(陽性率21.4%)、原位癌組織(陽性率46.3%)、浸潤性乳腺癌組織(陽性率71.3%)的表達(dá)依次增高；MMP-2陽性率在乳腺原位癌與不典型增生、浸潤性癌與原位癌之間具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。在浸潤性乳腺癌中，不同臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移亞組MMP-2陽性率比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。在原位癌中，MMP-2染色陽性組5年無病生存率(47.4%)低于陰性組(95.2%)；在浸潤性乳腺癌中，MMP-2染色陽性組5年無病生存率(56.9%)低于陰性組(86.5%)，均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論：MMP-2參與了乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的過程，并與乳腺癌預(yù)后相關(guān)，可作為預(yù)測乳腺癌預(yù)后的潛在腫瘤標(biāo)志物。

研究表明，腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(Extra-cellular matrix,ECM)之間相互作用的動態(tài)過程[1]，其中，腫瘤細(xì)胞通過直接或間接利用一些蛋白酶的作用來降解ECM和基底膜(Basement membrane，BM)，從而完成轉(zhuǎn)移過程。基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)是重要的蛋白水解酶之一，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切，其中明膠酶A(Matrix metalloproteinase-2，MMP-2)與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系是當(dāng)前研究的熱點[2]。本實驗通過檢測乳腺正常組織、不典型增生、原位癌、浸潤性癌組織中MMP-2表達(dá)水平，探討其作為乳腺癌標(biāo)志物的臨床價值。

材料與方法

1 材 料 收集西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院2004-2006年手術(shù)切除的正常乳腺組織標(biāo)本20例，乳腺不典型增生28例，導(dǎo)管內(nèi)癌40例，浸潤性導(dǎo)管癌80例。正常乳腺組織均取自距乳腺癌腫瘤邊緣5cm以外的正常乳腺組織。所有患者均為女性，年齡(43.26±5.43)歲，術(shù)前均未接受放、化療等其他治療，術(shù)后均有相應(yīng)的病理結(jié)果。對于浸潤性導(dǎo)管癌均行乳腺癌改良根治術(shù)，清除淋巴結(jié)數(shù)目均大于15枚。所有乳腺癌患者隨訪資料完整。

2 試劑與方法 鼠抗人MMP-2單克隆抗體、免疫組化染色SP試劑盒及DAB試劑盒均購自西安中杉生物有限公司。留取標(biāo)本，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，按試劑盒說明(SP法)進(jìn)行操作。行微波抗原修復(fù)，一抗工作濃度均為1∶100。PBS緩沖液代替一抗作陰性對照，用已知陽性的結(jié)腸癌組織切片作陽性對照。

3 結(jié)果判定 MMP-2陽性反應(yīng)物為棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞漿，免疫組化結(jié)果按陽性細(xì)胞百分比及陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分(Immunohistochemical scores，IHS)：IHS=a×b，a代表染色強(qiáng)度：無色，a=0；淺黃色，a=1；棕黃色，a=2；棕褐色，a=3。b代表陽性細(xì)胞百分比：陰性，b=0；陽性細(xì)胞1%～10%，b=1；陽性細(xì)胞11%～50%，b=2；陽性細(xì)胞51%～80%，b=3；陽性細(xì)胞81%以上，b=4。結(jié)果判斷時，IHS 0分定為陰性(-)，IHS 1～4分定為弱陽性(+)，IHS 5～8分定為陽性()，IHS 9～12分定為強(qiáng)陽性()。

4 統(tǒng)計學(xué)方法 由SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理。計數(shù)資料以例(%)表示，使用χ2檢驗或Fisher確切概率法，生存曲線用Kaplan-Meier方法，顯著性檢驗水平α=0.05。

結(jié) 果

1 免疫組化染色結(jié)果顯示，MMP-2陽性著色主要位于乳腺癌細(xì)胞漿中，在高倍鏡下呈棕黃色顆粒。在正常乳腺組織中MMP-2陽性染色4例(20.0%)，且以弱陽性為主；在乳腺不典型增生組織陽性染色6例(21.4%)；在原位癌組織陽性染色19例(46.3%)，在浸潤性乳腺癌組織陽性染色57例(71.3%)。MMP-2的染色陽性率在乳腺正常組織、不典型增生、原位癌、浸潤癌組織中依次增高；MMP-2染色陽性率在乳腺原位癌與不典型增生之間，以及在乳腺浸潤癌與原位癌之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見表1(圖1～4)。

表1 不同乳腺組織中MMP-2陽性結(jié)果表達(dá)的比較[例(%)]

2 MMP-2 在浸潤性乳腺癌中TNM分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期中陽性率分別為45.5%、65.9%、92.0%，其中，Ⅲ期和Ⅰ期、Ⅱ期之間均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，而Ⅰ期與Ⅱ期之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。MMP-2在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目分別為0、1～3、>3三組中的陽性率分別為50.0%、79.3%、84.0%。其中，MMP-2與乳腺癌淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，而與轉(zhuǎn)移數(shù)目無關(guān)。此外，MMP-2陽性率在不同月經(jīng)狀態(tài)、年齡、病理分級、腫瘤直徑大小、ER、PR、HER-2分組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見表2。

3 原位癌中MMP-2染色陰性組5年無病生存率為95.2%(20/21)染色，陽性組5年無病生存率為47.4%(8/19)，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖5。浸潤性乳腺癌中MMP-2染色陰性組5年生存率為86.5%(19/22)，染色陽性組5年生存率為56.9%(33/58)，兩組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，見圖6。

討 論

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與相關(guān)基因突變關(guān)系密切，根據(jù)流體力學(xué)原理，體積較小的腫瘤細(xì)胞從血管軸心處向血管壁移動，而易于附著血管壁不規(guī)則的地方，或附著于貼壁血栓上，有利于腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移[3]。MMPs家族是高度保守的依賴于鋅離子的內(nèi)切蛋白水解酶家族，可降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的大多數(shù)蛋白質(zhì)，目前發(fā)現(xiàn)近20余種MMPs[4]。MMP-2對于腫瘤進(jìn)展，一方面通過降解細(xì)胞外基質(zhì)、促進(jìn)新生血管生成、調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附等途徑促進(jìn)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[5-6]；另一方面，通過降解ECM和釋放特定的死亡誘導(dǎo)配體誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在乳腺癌、膽囊癌及膀胱癌等多種腫瘤中，MMP-2的促腫瘤作用更為明顯[5,7-8]。Noh S等[9]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌轉(zhuǎn)移高風(fēng)險女性中血清MMP-2含量顯著增高，并可作為乳腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險預(yù)測指標(biāo)。Pellikainen JM等[10]通過免疫組化方法測定421例原發(fā)性乳腺癌患者中MMP-2、MMP-9的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MMP-2、MMP-9在乳腺癌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的胞漿中均存在高表達(dá)，而且乳腺癌細(xì)胞中的MMP-2/-9表達(dá)主要和早期腫瘤有關(guān)，間質(zhì)細(xì)胞中的MMP-2/-9表達(dá)主要與腫瘤細(xì)胞的浸潤有關(guān)。本實驗的結(jié)果顯示：MMP-2染色陽性率在正常乳腺組織、不典型增生組織、原位癌以及浸潤性乳腺癌中依次升高的，但只在原位癌與不典型增生組之間(P<0.05)，以及浸潤性癌與原位癌之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。原位癌及浸潤癌中MMP-2的含量明顯高于正常組織，表明MMP-2在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起到了重要的作用。

乳腺癌與其他的實體腫瘤一樣，乳腺癌的浸潤、轉(zhuǎn)移都需要突破基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進(jìn)入血管或淋巴管并與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，再次突破基底膜和基質(zhì)等屏障，最后在靶器官內(nèi)形成新的轉(zhuǎn)移灶，MMP-2參與了這個過程中的多個階段。以往研究表明，MMP-2是影響乳腺癌患者預(yù)后因素之一，MMP-2過表達(dá)能夠促進(jìn)乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[11-12]。本實驗結(jié)果顯示：MMP-2 在浸潤性乳腺癌中臨床分期分別為Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期中的陽性表率分別為45.5%、65.9%、92.0%，Ⅲ期與Ⅰ期、Ⅱ期之間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，而Ⅰ期、Ⅱ期之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。MMP-2在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目分別為0、1～3、>3的三個組中的陽性表達(dá)率分別為50.0%、79.3%、84.0%。其中，MMP-2與乳腺癌淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，但是與轉(zhuǎn)移的數(shù)目無關(guān)。

目前，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移被看作是乳腺癌的一個獨立預(yù)后因素已經(jīng)被廣泛的接受。王周權(quán)報道[13]，多因素分析顯示，淋巴結(jié)狀態(tài)和脈管瘤栓是影響預(yù)后的獨立因素。本研究提示，MMP-2在乳腺癌中與淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移及腫瘤的臨床分期有關(guān)，因此，我們猜測MMP-2與乳腺癌預(yù)后可能存在相關(guān)性。本研究對120例乳腺癌患者5年隨訪，結(jié)果顯示：原位癌中MMP-2染色陰性組5年無病生存率(95.2%)明顯高于染色陽性組(47.4%)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；同時，浸潤性乳腺癌中MMP-2染色陰性組5年生存率(86.5%)也明顯高于染色陽性組5年生存率(56.9%)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，上述結(jié)果與國外研究報道一致。我們認(rèn)為，MMP-2可以作為月乳腺癌患者手術(shù)預(yù)后的潛在標(biāo)志物。

綜上，MMP-2參與了乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的過程，并與乳腺癌的預(yù)后相關(guān)，是乳腺癌預(yù)后潛在標(biāo)志物。

[1] Catteau X,Simon P,Noel JC. Stromal expression of matrix metalloproteinase 2 in cancer-associated fibroblasts is strongly related to human epidermal growth factor receptor 2 status in invasive breast carcinoma[J]. Mol Clin Oncol,2016,4(3):375-378.

[2] 陳國俊,王 健.MMP-2和MMP-9在膀胱癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究[J]. 陜西醫(yī)學(xué)雜志，2007,36(1):41-44.

[3] 劉永惠，郭少賢，常 靖，等.丹參酮對血瘀證乳腺癌P53基因、mdm2基因表達(dá)的影響[J]. 陜西中醫(yī)，2011,32(12):1666-1667.

[4] 吳正升，吳 強(qiáng)，楊 楓.乳腺癌組織明膠酶的表達(dá)及其與TGFβ1的關(guān)系[J]. 陜西醫(yī)學(xué)雜志，2004,33(11):967-970.

[5] Ben Néjima D,Ben Zarkouna Y,Gammoudi A,etal.Prognostic impact of polymorphism of matrix metalloproteinase-2 and metalloproteinase tissue inhibitor-2 promoters in breast cancer in Tunisia: case-control study[J]. Tumour Biol,2015,36(5):3815-3822.

[6] Niemiec JA,Adamczyk A,Malecki K,etal. Relationships between immunophenotype,Ki-67 index,microvascular density,Ep-CAM/P-cadherin,and MMP-2 expression in early-stage invasive ductal breast cancer[J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol,2012,20(6):550-560.

[7] Sharma KL,Misra S,Kumar A,etal. Higher risk of matrix metalloproteinase (MMP-2,7,9) and tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP-2) genetic variants to gallbladder cancer[J].Liver Int,2012,32(8): 1278-1286.

[8] Henriques AC,Vasconcelos MG,Galvao HC,etal. Comparative analysis of the immunohistochemical expression of collagen IV,MMP-9,and TIMP-2 in odontogenic cysts and tumors[J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod,2011,112(4): 468-475.

[9] Noh S,Jung JJ,Jung M,etal. Body fluid MMP-2 as a putative biomarker in metastatic breast cancer[J].Oncol Lett,2012,3(3): 699-703.

[10] Pellikainen JM,Ropponen KM,Kataja VV,etal.Expression of matrix metalloproteinase (MMP)-2 and MMP-9 in breast cancer with a special reference to activator protein-2,HER2,and prognosis[J]. Clin Cancer Res,2004,10(22):7621-7628.

[11] Mohammad MA,Zeeneldin AA,Abd EZY,etal. Clinical relevance of cyclooxygenase-2 and matrix metalloproteinases (MMP-2 and MT1-MMP) in human breast cancer tissue[J]. Mol Cell Biochem,2012,366(1-2): 269-275.

[12] Zhang S,Ma J,Fu Z,etal. Promotion of breast cancer cells MDA-MB-231 invasion by di(2-ethylhexyl)phthalate through matrix metalloproteinase-2/-9 overexpression[J]. Environ Sci Pollut Res Int,2016,23(10):9742-9749.

[13] 王周權(quán).老年乳腺癌140例臨床病例特點及預(yù)后分析[J]. 陜西醫(yī)學(xué)雜志，2009,38(11):1504-1506.

ExpressionsandclinicalsignificanceofMMP-2inbreastcancer

Wang Guanghui,Wang Huxia ,Chen Nan，et al

The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710061)

Objective:To study the expression of matrix metalloproteinase-2(MMP-2 )in normal tissue of breast，atypical hyperplasia，ductal carcinoma in situ and invasive carcinoma,and analyze the associations with pathological features and clinical outcome in human breast cancer. Methods:Expressions of MMP-2 in 20 cases of normal breast tissue ,28 cases of atypical hyperplasia,40 cases of ductal carcinoma in situ (DCIS) and 80 cases of invasive carcinoma were determined by IHC(immune ohistochemistry) technique respectively. The level of MMP-2 expression in 80 cases of invasive breast cancer was analyzed against the clinical and pathology features such as tumor diameter,lymph node status and so on. All the 120 cases of breast carcinoma were followed-up. Results:The expression of MMP-2 increased from normal tissue of breast(the positive rate 20.0%) to atypical hyperplasia (the positive rate 21.4%) and DCIS (the positive rate 46.3%) and invasive breast cancer (the positive rate 71.3%).There was statistical difference between DCIS and atypical hyperplasia (P<0.05). While there was statistical difference between invasive carcinoma and DCIS (P<0.05). The expression of MMP-2 had statistically significant differences in some groups of different clinical stage and lymph node metastasis (P<0.05).Disease free survival rate of ductal carcinoma in situ group with MMP-2 positive expression(47.4%) was lower than the negative group(95.2%)(P<0.05). Disease free survival rate of the invasive carcinoma group with MMP-2 positive expression(56.9%) was lower than the negative group(86.5%)(P<0.05). Conclusions: MMP-2 participate the course of breast cancer. It may be a prognostic indicator of breast cancer.

Breast neoplasms/pathology Gehalinases Hyperplasia/analysis Prognosis

*陜西省自然科學(xué)基金資助項目(2014D4)

乳腺腫瘤/病理學(xué) 增生 明膠酶類/分析 預(yù)后

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.11.008

(收稿：2017-04-07)