高烏頭藥材常規(guī)項檢查及高烏甲素、冉烏頭堿含量測定

張立軍 戴海蓉 樊秦 夏鵬飛 沈秉學 李蕓

摘要：目的 對高烏頭藥材進行常規(guī)項檢查并測定高烏甲素、冉烏頭堿含量，為建立高烏頭藥材質量標準提供參考。方法 采集不同產地高烏頭藥材，采用薄層色譜法進行定性鑒別，按藥典水分測定法（烘干法）、灰分測定法、浸出物測定法測定水分、灰分和浸出物，采用HPLC測定高烏甲素和冉烏頭堿含量。結果 薄層色譜斑點清晰，分離度好；暫定高烏頭藥材中水分、總灰分及酸不溶性灰分分別不得過11.0%、12.0%、7.0%，水溶性浸出物和醇溶性浸出物分別不少于18.2%、10.6%；高烏頭藥材中冉烏頭堿和高烏甲素含量分別不少于0.125%、0.815%。結論 本研究所建立的方法準確可靠，可用于高烏頭藥材質量評價。

關鍵詞：高烏頭；常規(guī)檢查；高效液相色譜法；高烏甲素；冉烏頭堿

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.015

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）11-0063-04

Routine Examination of Aconitum sinomontanum Nakai and Content Determination of Lappacontine and Ranaconitine ZHANG Li-jun1， DAI Hai-rong1， FAN Qin2， XIA Peng-fei2， SHEN Bing-xue1， LI Yun1 （1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese （Tibetan） Medicines of Colleges of Gansu Province， Lanzhou 730000， China）

Abstract： Objective To study the routine examination of Aconitum sinomontanum Nakai and determine the contents of lappacontine and ranaconitine； To provide basis for establishing the quality standard of Aconitum sinomontanum Nakai. Methods Aconitum sinomontanum Nakai were collected from different areas. A method of TLC was used for qualitative discrimination. The methods in the Chinese Pharmacopoeia were adopted for the determination of moisture content， ash content and extractives. Determination of lappacontine and ranaconitine were performed by HPLC. Results The TLC showed that the spots were clear and the separation was good. Individual provisional standards： the moisture， total ash and acid-insoluble ash content of Aconitum sinomontanum Nakai were not more than 11.0%， 12.0%， and 7.0%， respectively； water soluble and alcohol soluble extractives were not less than 18.2% and 10.6%， respectively. The content of ranaconitine and lappacontine in Aconitum sinomontanum Nakai were not less than 0.125% and 0.815%， respectively. Conclusion The method established by the study is accurate and reliable， and can be used for quality evaluation of Aconitum sinomontanum Nakai.

Key words： Aconitum sinomontanum Nakai； routine examination； HPLC； lappacontine； ranaconitine

高烏頭為毛茛科烏頭屬植物高烏頭Aconitum sinomontanum Nakai的根，又名麻布七、辮子七、破骨七等，是我國甘肅等中西部地區(qū)民間習用中藥，也是著名“七藥”之一[1]，具有祛風除濕、理氣止痛、活血散瘀的功效，用于治療風濕痹痛、關節(jié)腫痛、跌打勞傷等。現(xiàn)代藥理研究表明，高烏頭具有鎮(zhèn)痛、抗炎、解熱、局部麻醉、抗心律失常、抗氧化、殺蟲等廣泛的藥理作用[2-4]，臨床上常用于治療類風濕關節(jié)

基金項目：國家自然科學基金（81560650）；甘肅省自然科學基金（1107RJZA242）

通訊作者：李蕓，E-mail：liyunherb@163.com

炎及局部鎮(zhèn)痛[5-6]。高烏頭的主要活性成分為二萜生物堿[7]，其中以高烏甲素和冉烏頭堿的含量最高[8]，而活性成分之一高烏甲素已開發(fā)出不同劑型并應用于臨床[9]。

高烏頭為我國特有植物，在北方地區(qū)有著豐富的資源分布，目前甘肅地區(qū)引種馴化成功、大量生產和應用，現(xiàn)已成為甘肅地產大宗商品藥材。高烏頭收載于《甘肅省中藥材標準》（2009年版）[10]，現(xiàn)有的標準尚不完善，既無常規(guī)項檢查，也無含量測定項。為此，本試驗采用常規(guī)項檢查及高烏甲素、冉烏頭堿含量對其進行質量評價，以保證臨床用藥安全有效，并為高烏頭藥材質量標準的制訂和完善提供參考。

1 儀器與試藥

BT125D電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；KQ3200DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FW-400A高建萬能粉碎機（北京科偉永興儀器有限公司）；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；RJX-4-9型號箱形電阻爐（天津實驗電爐廠）；HHS-11S數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）；Agilent 1100 Series型高效液相色譜儀，DAD檢測器（美國Agilent科技有限公司）；SHB-3循環(huán)水多用真空泵（鄭州杜甫儀器廠）；PHS-430型pH計（方舟電子科技有限責任公司）；旋轉蒸發(fā)儀、稱量瓶、干燥器、無灰濾紙等。

高烏甲素對照品（甘肅神龍藥業(yè)股份有限公司，批號20001001，HPLC純度≥97.50%），冉烏頭堿對照品（成都克洛瑪生物科技有限公司，批號150404，HPLC純度≥98.00%）；甲醇、三乙胺均為色譜純，三氯甲烷、氨水、正己烷、異丙醇、乙酸乙酯、95%乙醇為分析純。

高烏頭藥材分別購于甘肅、青海等地，經甘肅中醫(yī)藥大學藥學院楊扶德教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物高烏頭Aconitum sinomontanum Nakai的干燥根，樣品信息見表1。

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別

取高烏頭藥材粉末2 g（過4號篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，再加入異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，稱定質量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz，水溫25 ℃以下）30 min，放冷，補足減失的質量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液25 mL，40 ℃以下減壓回收溶劑至干，殘渣加入甲醇3 mL，溶解，密塞，搖勻，作為供試品溶液。另取冉烏頭堿、高烏甲素對照品，分別加甲醇溶解，制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法試驗，分別吸取冉烏頭堿、高烏甲素對照品、供試品溶液各5 ?L，點于同一硅膠GF254薄層板上，以正己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（5∶6∶8∶1.5）為展開劑，置氨蒸氣飽和20 min后展開，取出，晾干，分別置紫外光燈（254、365 nm）下檢視（溫度18～30 ℃，濕度45%～60%）。結果供試品色譜中，在與對照品相應的位置上，顯相同顏色的斑點。

2.2 檢查

2.2.1 水分測定 取高烏頭藥材粉末4 g（過4號篩），平行3份，精密稱定，按照2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則0832水分測定項下第二法（烘干法）進行測定。

2.2.2 總灰分測定 取高烏頭藥材粉末4 g（過4號篩），平行3份，置熾灼至恒重的坩堝中，稱定質量，按照2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則2302總灰分測定項下方法測定。如果供試品不易灰化，可將坩堝放冷，加熱水或10%硝酸鐵溶液2 mL，使殘渣濕潤，然后置水浴上蒸干，殘渣繼續(xù)熾灼，至坩堝內容物完全灰化。

2.2.3 酸不溶性灰分測定 取“2.2.2”項下所得的灰分，按2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則2302總灰分測定項下酸不溶性灰分測定法測定。

2.2.4 浸出物測定

2.2.4.1 水溶性浸出物 取高烏頭藥材粉末4 g（過4號篩），平行3份，精密稱定，按照2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則2201水溶性浸出物測定項下熱浸法進行測定。

2.2.4.2 醇溶性浸出物 取高烏頭藥材粉末4 g（過4號篩），平行3份，精密稱定。分別用45%、55%、65%、75%、85%、95%乙醇作為溶劑，按照2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則2201醇溶性浸出物測定項下熱浸法進行測定，計算得醇溶性浸出物含量分別為33.9%、28.9%、24.1%、19.5%、17.4%、12.5%。可見，隨著乙醇濃度的降低，醇溶性浸出物較多，但同時溶出的雜質也多；95%乙醇浸出物較少，不能完全提取出高烏頭中的各類成分。綜合以上因素，選用稀乙醇（47.5%）作溶劑測定樣品中的醇溶性浸出物，一方面能夠溶出高烏頭中各類主要成分，另一方面便于用市售的95%乙醇配制成稀乙醇。

取高烏頭粉末約4 g（過4號篩），平行3份，精密稱定，以稀乙醇作為溶劑，按上述操作方法進行測定。

2.3 指標成分含量測定

2.3.1 色譜條件 采用DIKMA Spursil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流動相A為三乙胺水溶液（pH 9.3～9.6）、B為甲醇，梯度洗脫（0～30 min，5%～35%B，流速0.4 mL/min；30～70 min，30%～100%B，流速0.4 mL/min；70～80 min，100%B，流速0.4 mL/min；80～85 min，100%B，流速1.0 mL/min）；檢測波長308 nm；柱溫35 ℃。

2.3.2 對照品溶液的制備 分別取冉烏頭堿、髙烏甲素對照品，精密稱定，加甲醇溶解并定容，制成冉烏頭堿和高烏甲素對照品溶液，再分別精密量取上述2種對照品溶液適量，配制混合對照品溶液（冉烏頭堿0.172 5 mg/mL，高烏甲素0.375 0 mg/mL）。在上述色譜條件下，冉烏頭堿與高烏甲素能夠很好地分離，色譜圖見圖1。

2.3.3 供試品溶液的制備 取高烏頭藥材粉末1 g（過4號篩），精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，再加入異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，稱定質量，超聲處理（頻率50 kHz，水溫25 ℃）30 min，放冷，補足減失的質量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液10 mL，40 ℃以下減壓回收溶劑，殘渣加甲醇溶解，定容至25 mL，密塞，搖勻，進樣前用0.45 ?m微孔膜過濾，作為供試品溶液。

2.3.4 線性關系考察 分別精密吸取混合對照品溶液0.5、1、2、4、6、8、10 ?L進樣分析，測定峰面積，以峰面積對進樣量進行線性回歸。結果表明，高烏甲素在0.187 5～3.750 ?g范圍內線性關系良好，回歸方程Y=1158.8X+2.128，r=0.999 9；冉烏頭堿在0.086 25～1.725 0 ?g范圍內線性關系良好，回歸方程Y=1195.3X-2.035，r=0.999 8。

2.3.5 精密度試驗 精密吸取對照品混合溶液20 ?L，按上述色譜條件進樣分析，連續(xù)進樣5次，結果冉烏頭堿、高烏甲素峰面積的RSD分別為0.76%、0.98%，表明儀器的精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、24 h按上述色譜條件進樣測定，記錄冉烏頭堿、高烏甲素峰面積，結果峰面積的RSD分別為2.36%、1.51%，表明24 h內樣品的穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復性試驗 取同一批次樣品粉末，平行稱取5份，按供試品溶液的制備方法進行制備，按上述色譜條件進行測定，計算樣品中高烏甲素和冉烏頭堿的含量，結果高烏甲素和冉烏頭堿含量的RSD分別為2.51%、1.62%，表明本法有良好的重復性。

2.3.8 加樣回收率試驗 取已知含量的高烏頭藥材粉末0.5 g（高烏甲素含量為1.240%，冉烏頭堿含量為0.239%），共5份，精密稱定，分別加入與其含有等量的高烏甲素和冉烏頭堿對照品，按供試品溶液制備方法制備，依法測定，計算高烏甲素和冉烏頭堿的平均回收率均分別為97.94%、101.73%，RSD分別為2.50%、3.15%，表明本方法回收率良好，結果見表2。

2.3.9 樣品含量測定 取5批次高烏頭藥材供試品溶液，分別精密吸取20 ?L注入液相色譜儀，記錄色譜圖，并按外標法以峰面積計算樣品中高烏甲素、冉烏頭堿的含量，色譜圖見圖2。

2.4 檢查項及含量測定結果（見表3）

以統(tǒng)計學方法分析數(shù)據(jù)，設定高烏頭藥材水分、總灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、冉烏頭堿及高烏甲素的上下限，計算公式如下[11-12]：

上限μ= +（t×s）/√n+MU，下限μ= -（t×s）/√n-MU

式中，—x為樣本均數(shù)；t為置信水平為99%的t值（單側），t（0.01，4）=4.604；s為樣本標準偏差；n為樣本批數(shù)；MU是不確定度評估，水分MU=0.126 0—x，總灰分MU=0.052 0—x，酸不溶性灰分MU=0.070 2—x，水溶性浸出物MU=0.127 5—x，醇溶性浸出物MU=0.141 5—x，冉烏頭堿MU=0.223 5—x，高烏甲素MU=0.231 5—x。

水分：μ= +（t×s）/√n+MU=7.320+ （4.604×1.033）/√5+0.9221=10.369

總灰分：μ= +（t×s）/√n+MU=8.400+ （4.604×1.407）/√5+0.437=11.734

酸不溶性灰分：μ= +（t×s）/√n+MU=3.500+ （4.604×1.243）/√5+0.246=6.305

水溶性浸出物：μ= -（t×s）/√n-MU=32.760- （4.604×5.030）/√5-4.177=18.226

醇溶性浸出物：μ= -（t×s）/√n-MU=28.560- （4.604×6.755）/√5-4.041=10.611

冉烏頭堿：μ= -（t×s）/√n-MU=0.216- （4.604×0.021）/√5-0.048=0.125

高烏甲素：μ= -（t×s）/√n-MU=1.243- （4.604×0.068）/√5-0.288=0.815

可知，高烏頭藥材的水分、總灰分及酸不溶性灰分應分別不得過11.0%、12.0%、7.0%，水溶性浸出物、醇溶性浸出物應分別不少于18.2%、10.6%；按干燥品計算，高烏頭藥材中冉烏頭堿與高烏甲素的含量應不少于0.125%、0.815%。

3 討論

高烏頭是一味民間常用中藥，一直以來，有關其質量控制方面的研究鮮有文獻報道。現(xiàn)有的質量標準指標過于簡單，不能很好地控制其質量。本課題首次從常規(guī)檢查和定量分析角度對高烏頭進行了質量評價研究，為新版《甘肅省中藥材標準》中高烏頭藥材標準的完善提供依據(jù)。

薄層鑒別試驗分別考察了正己烷、二甲苯、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇等多種溶劑展開系統(tǒng)，曾用三氯甲烷-甲醇-氨水（7∶2∶0.50）、二甲苯-甲醇（5∶1）等，經過多次試驗和篩選，最終確定上述展開條件，結果表明該條件具有分離度好、斑點清晰、簡便易行等特點，可用于高烏頭藥材的薄層鑒別分析。

本試驗建立了HPLC同時測定高烏頭藥材中冉烏頭堿、高烏甲素的方法。該方法專屬性強、靈敏度高、重復性好，可用于評價高烏頭藥材的質量。同時，試驗采用藥典方法對不同批次高烏頭藥材中水分、總灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物和醇溶性浸出物進行測定，得出了較為準確的數(shù)據(jù)，為建立藥材標準提供依據(jù)。

高烏頭在功效上與同科同屬的烏頭（川烏、草烏）作用相當，但高烏頭不含極毒的雙酯型烏頭堿類成分，臨床應用相對烏頭更加安全。烏頭可以引起動物心律失常[13]，而高烏頭則具有抗烏頭堿心律失常的作用。高烏頭一直作為地方用藥，究其原因，一方面是其標準不夠完善，另一方面是產量較低、使用范圍小，未能引起重視。如果解決以上問題，高烏頭很有可能代替烏頭藥材，載入藥典標準。

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