漢防己乙素對人肺癌95D細胞凋亡的誘導作用及機制

于有江 ，羅雪，葉記林，蘇蘭娣，彭建明

(揚州市職業大學醫學院，江蘇揚州 225009)

漢防己乙素對人肺癌95D細胞凋亡的誘導作用及機制

于有江 ，羅雪，葉記林，蘇蘭娣，彭建明

(揚州市職業大學醫學院，江蘇揚州 225009)

目的觀察漢防己乙素對人肺癌95D細胞凋亡的誘導作用，并探討其可能的作用機制。方法取人肺癌95D細胞分為4組，實驗1、2、3組分別加入8、16、32 μmol/L的漢防己乙素，溶劑對照組加入等體積0.1%的DMSO。采用流式細胞儀測算各組細胞凋亡率，H2DCF-DA法測定細胞內活性氧(ROS)水平，Caspase-3活性測定試劑盒檢測Caspase-3活性，半定量RT-PCR法檢測BCL-2、BAX mRNA。結果實驗1、2、3組及溶劑對照組細胞凋亡率分別為6.71%±1.26%、17.07%±1.88%、25.78%±0.44%、5.41%±1.40%，ROS水平分別為117.7%±5.5%、151.0%±4.6%、212.0%±5.6%、100.0%±0.0%,Caspase-3活性分別為119.3%±5.7%、175.0%±13.1%、251.3%±17.0%、100.0%±3.0%，BCL-2 mRNA相對表達量分別為0.93±0.02、0.75±0.04、0.61±0.04、1.00±0.03，BAX mRNA相對表達量分別為1.10±0.02、1.63±0.04、1.85±0.04、1.00±0.02，實驗1、2、3組與溶劑對照組相比P<0.05或<0.01。結論漢防己乙素可誘導人肺癌95D細胞凋亡，這可能是通過升高細胞內ROS水平、活化Caspase-3、激活BAX、抑制BCL-2實現的。

肺腫瘤；漢防己乙素；細胞凋亡；活性氧；半胱氨酸蛋白酶3；B淋巴細胞瘤-2；BCL-2相關X蛋白

近年來，肺癌的治療取得了較大的進展，但5年生存率仍低于10%。漢防己乙素是從中藥粉防己等植物中提取的化學活性成分之一，具有降低血糖、抑制主動脈血管平滑肌細胞增殖、抗高血壓和抗氧化等多種生物學功能[1,2]。近年來發現，漢防己乙素對乳腺癌、肝癌、前列腺癌、白血病等多種惡性腫瘤具有良好的抗癌效果[2～5]。但迄今為止，關于漢防己乙素在肺癌中作用的報道較少，其具體的分子機制尚不明確。細胞凋亡是抗癌藥物抑制腫瘤生長的重要機制之一，活性氧(ROS)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、B淋巴細胞瘤-2(BCL-2)和BCL-2相關X蛋白(BAX)在細胞凋亡中起重要作用。2016年5～``月，本研究觀察了漢防己乙素對人肺癌95D細胞凋亡的誘導作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞來源及主要試劑 人肺癌95D細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。漢防己乙素購自上海詩丹德生物公司，純度為98%，用二甲基亞砜(DMSO)配成200 mmol/L的貯存液。DMEM培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)為AMRESO產品；Annexin V-PI細胞凋亡檢測試劑盒、ROS測定試劑盒和Caspase-3活性測定試劑盒購自上海碧云天生物技術公司。

1.2 細胞培養 將人肺癌95D細胞接種于DMEM培養液(含10%胎牛血清)，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。取對數生長期細胞用于以下實驗。

1.3 漢防己乙素濃度篩選 采用MTT法觀察細胞增殖能力。取對數生長期細胞，調整細胞密度為5×104/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL。24 h后藥物組加入不同濃度(2、4、8、16、24、32、48、64 μmol/L)的漢防己乙素，溶劑對照組加等體積0.1%的DMSO，同時設不加細胞只加培養液的孔為空白對照。終止培養前4 h每孔加入10 μL MTT。培養4 h后，吸棄上清，每孔加入100 μL DMSO溶解反應產物，在酶標儀上檢測492 nm時的OD值。細胞存活率=(藥物組OD值-空白對照OD值)/(溶劑對照組OD值-空白對照OD值)×100%。2、4、8、16、24、32、48、64 μmol/L漢防己乙素處理人肺癌95D細胞存活率分別為94.8%±2.4%、86.3%±0.2%、71.7%±0.8%、61.2%±1.4%、38.5%±1.6%、19.5%±2.4%、15.2%±3.5%、13.2%±3.1%，取8、16、32 μmol/L的漢防己乙素進行下述實驗以便于觀察細胞凋亡情況。

1.4 細胞凋亡率測算 取對數生長期細胞，調整細胞密度為1×105/mL，接種于6孔板中，每孔3 mL。實驗1、2、3組24 h后加入不同濃度(8、16、32 μmol/L)的漢防己乙素，溶劑對照組加等體積0.1%的DMSO。48 h后，將各組細胞用胰酶消化，離心收集細胞，PBS洗滌2次后用500 μL Binding buffer重懸細胞，并先后加入Annexin V和碘化丙啶(PI)輕輕混勻。室溫避光孵育15 min后，采用流式細胞儀檢測，計算細胞凋亡率。

1.5 細胞內ROS水平檢測 細胞處理方法同1.4。48 h后，將各組細胞用胰酶消化，離心收集細胞，PBS洗滌后加入H2DCF-DA熒光探針至終濃度為10 μmol/L，在37 ℃下避光孵育30 min，采用流式細胞儀測定細胞內ROS的變化。

1.6 細胞Caspase-3活性檢測 取對數生長期細胞，調整細胞密度為1×105/mL，接種于T75培養瓶中，每瓶15 mL。實驗1、2、3組24 h后加入不同濃度(8、16、32 μmol/L)的漢防己乙素，溶劑對照組加等體積0.1%的DMSO。48 h后，將各組細胞用胰酶消化，離心收集細胞，PBS洗滌2次后按照Caspase-3活性測定試劑盒方法進行測定。吸盡上清后，按照每200萬細胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min。4 ℃ 16 000 r/min離心15 min。把上清轉移到冰浴預冷的離心管中。設置如下反應體系：樣品50 μL、檢測緩沖液40 μL、2 mmol/L Ac-DEVD-pNA 10 μL，對照組加入50 μL裂解液作為對照。37 ℃孵育60～120 min后測定405 nm處的OD值。Caspase-3相對活性=實驗組或溶劑對照組OD值/對照組OD值。

1.7 細胞BCL-2、BAX mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。細胞處理方法同1.4。48 h后，取實驗1、2、3組和溶劑對照組細胞，用TRIzol 抽提細胞總RNA，逆轉錄為互補DNA(cDNA)，取適量cDNA為模板，PCR法檢測。引物序列如下：BCL-2上游引物為5′-GGTCGCCAGGACCTCGCCGC-3′，下游引物為5′-AGTCGTCGCCGGCCTGGCG-3′；BAX上游引物為5′-GAGCTGCAGAGGATGATTGC-3′，下游引物為5′-AGCCCAACAGCCGCTCCCGG-3′；GAPDH上游引物為5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′，下游引物為5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。采用Quantity One 軟件進行分析，以GAPDH條帶為內參，對目的條帶(BCL-2和BAX)的光密度值進行半定量分析，進而得到其相對表達量。

2 結果

2.1 各組細胞凋亡率比較 實驗1、2、3組細胞凋亡率分別為6.71%±1.26%、17.07%±1.88%、25.78%±0.44%，與溶劑對照組(5.41%±1.40%)相比P<0.05或<0.01。

2.2 各組細胞內ROS水平比較 實驗1、2、3組細胞內ROS水平分別為117.7%±5.5%、151.0%±4.6%、212.0%±5.6%，與溶劑對照組(100.0%±0.0%)相比P均<0.01。

2.3 各組細胞Caspase-3活性比較 實驗1、2、3組細胞Caspase-3活性分別為119.3%±5.7%、175.0%±13.1%、251.3%±17.0%，與溶劑對照組(100.0%±3.0%)相比P<0.05或<0.01。

2.4 各組細胞BCL-2、BAX mRNA表達比較 見表1。

表1 各組細胞BCL-2、BAX mRNA表達比較

注：與溶劑對照組相比，*P<0.05，#P<0.01。

3 討論

漢防己乙素對多種惡性腫瘤具有較好的抑制作用，如肝癌、前列腺癌、白血病以及乳腺癌等，作用機制包括誘導細胞周期阻滯、促進細胞凋亡、抑制細胞遷移和侵襲等[1～3]。然而，漢防己乙素在肺癌中的作用研究較少。本研究結果發現，實驗1、2、3組人肺癌95D細胞較溶劑對照組凋亡率高，表明漢防己乙素能有效地誘導腫瘤細胞凋亡。

誘導腫瘤細胞凋亡是現代抗癌藥物研究的一個重要分支[6,7]。多數臨床使用的抗癌藥物能夠通過誘導細胞凋亡來抑制腫瘤細胞增殖[8]。ROS能夠介導多種細胞內的信號通路信號傳遞[9,10]，還參與脂質過氧化過程，并能介導連接硫醇基類的蛋白。本研究結果發現，實驗1、2、3組細胞內ROS水平較溶劑對照組高，表明漢防己乙素能升高人肺癌95D細胞內的ROS水平。ROS產生過多能導致氧化應激、細胞功能失常、線粒體通透性轉換孔開放，進一步引起細胞凋亡。可見ROS在漢防己乙素引起的腫瘤細胞凋亡中起重要作用。但漢防己乙素通過何種途徑升高ROS尚需要進一步研究。

Caspases是半胱氨酸蛋白酶家族蛋白，能通過控制死亡受體和線粒體通路來促進細胞凋亡。Caspases蛋白平常以失活的酶原形式存在，在細胞凋亡中則以活化的酶形式存在。Caspase-3是Caspases家族蛋白中主要的蛋白酶之一，能夠催化多種主要的細胞內蛋白的特異性剪切。BCL-2和BAX分別是BCL-2家族中最有代表性的抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。在凋亡發生過程中，BAX在某些凋亡相關因素的激活下，促進細胞線粒體內的細胞色素C釋放到胞質，通過級聯反應最終導致細胞凋亡。本研究結果發現，與溶劑對照組相比，實驗1、2、3組細胞Caspase-3活性高，BAX mRNA表達高，BCL-2 mRNA表達低。提示漢防己乙素可通過誘導Caspase-3的活化和BCL-2/BAX失衡，進而促發細胞凋亡。

綜上所述，漢防己乙素可誘導人肺癌95D細胞凋亡，這可能是通過升高細胞內ROS水平、活化Caspase-3、激活BAX、抑制BCL-2實現的。

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Effectoffangchinolineonproliferationofhumanlungcancer95Dcells

YUYoujiang,LUOXue,YEJilin,SULandi,PENGJianming

(MedicalCollegeofYangzhouPolytechnicCollege,Yangzhou225009,China)

ObjectiveTo investigate the inducible effect and possible mechanism of fangchinoline on apoptosis of human lung cancer 95D cells.MethodsThe human lung cancer 95D cells were divided into four groups: experimental groups 1, 2, 3, and the control group. The cells in the experimental groups 1, 2, and 3 were added with 8, 16, and 32 μmol/L fangchinoline, respectively. Cells in the control group were added with the same volume of 0.1% DMSO. The apoptosis was measured by flow cytometry. The levels of cellular reactive oxygen species (ROS) and Caspase-3 activity were detected by H2DCF-DA and Caspase-3 activity assay. The BCL-2 and BAX mRNA expression was determined by semi-quantitative RT-PCR.ResultsThe apoptosis rate of the experimental groups 1, 2, 3 and control group were 6.71%±1.26%, 17.07%±1.88%, 25.78%±0.44%, and 5.41%±1.40%, respectively; the relative ROS levels of the experimental groups 1, 2, 3 and control group were 117.7%±5.5%, 151.0%±4.6%, 212.0%±5.6%, and 100.0%±0.0%, respectively; the activities of Caspase-3 of the experimental groups 1, 2, 3 and control group were 119.3%±5.7%, 175.0%±13.1%, 251.3%±17.0%, and 100.0%±3.0%, respectively; the levels of BCL-2 mRNA of the experimental groups 1, 2, 3 and control group were 0.93±0.02, 0.75±0.04, 0.61±0.04, and 1.00±0.03, respectively; the levels of BAX mRNA of the experimental groups 1, 2, 3 and control group were 1.10±0.02, 1.63±0.04, 1.85±0.04, 1.00±0.02, respectively. Significant difference was found between the the experimental groups 1, 2, 3 and the control group (P<0.05 orP<0.01).ConclusionFangchinoline may induce the apoptosis of human lung cancer 95D cells by increasing the cellular ROS, activating Caspase-3 and Bax, and inhibiting Bcl-2.

lung neoplasms; fangchinoline; apoptosis; reactive oxygen species; Caspase-3; B lymphocytoma-2; BCL-2 associated X protein

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.38.002

R730.1

A

1002-266X(2017)38-0005-03

江蘇省衛生廳衛生職業技術教育科研資助項目(NJ201410)。

于有江(1963-)，男，副教授，主要研究方向為細胞凋亡、生物化學與分子生物學。E-mail： 836485572@qq.com

彭建明(1984-)，男，副教授，主要研究方向為細胞凋亡、鎮痛。E-mail： shmily_peng@163.com

2017-06-29)