補中益氣湯灌胃對右下肺癌肺葉切除術后大鼠外周血T細胞水平的影響

李小海，黎建軍，郭亞雄，王百林，張雪燕，張貴平

(1廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣州 510405；2深圳市龍華區中心醫院；3中山大學附屬腫瘤醫院；4廣州醫科大學)

補中益氣湯灌胃對右下肺癌肺葉切除術后大鼠外周血T細胞水平的影響

李小海1，2，黎建軍3，郭亞雄1，王百林1，張雪燕4，張貴平4

(1廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣州 510405；2深圳市龍華區中心醫院；3中山大學附屬腫瘤醫院；4廣州醫科大學)

目的觀察補中益氣湯灌胃對右下肺癌肺葉切除術后大鼠外周血T細胞水平的影響。方法Wistar大鼠80只，制備大鼠右下肺鱗癌模型。取模型制備成功大鼠60只，將其隨機分為實驗組及對照組各30只，均行右下肺葉切除。自術后次日實驗組經口給予補中益氣湯灌胃，100 mL/(kg·d)；對照組等量生理鹽水灌胃。右下肺葉切除術中取各組右下肺血管內不凝血50 μL作為術前血；術后第3、7、14天分別處死實驗組、對照組10只大鼠，取大鼠眼眶靜脈不凝血50 μL。用流式細胞儀檢測各組大鼠術前及術后第3、7、14天外周血CD3+、CD4+、CD8+T細胞水平，并計算CD4+/CD8+。結果與本組術前相比，術后實驗組、對照組術后第3天外周血CD3+、CD4+T細胞水平及CD4+/CD8+均低，CD8+T細胞水平高(P均<0.05)。實驗組術后第7天較術前及對照組術后第7天外周血CD3+、CD4+T細胞水平及CD4+/CD8+高，CD8+T細胞水平低(P均<0.05)。與本組術前相比，實驗組和對照組術后第14天外周血CD3+、CD4+T細胞水平及CD4+/CD8+均高，CD8+T細胞水平均低(P均<0.05)，而術后兩組相比P均>0.05。實驗組術后第3、7、14天外周血CD3+、CD4+、CD8+T細胞水平及CD4+/CD8+兩兩相比P均<0.05。結論補中益氣湯灌胃可提高右下肺癌肺葉切除術后大鼠外周血CD3+、CD4+T細胞水平及CD4+/CD8+，并降低CD8+T細胞水平。

補中益氣湯；肺腫瘤；肺葉切除術；T淋巴細胞；大鼠

近年來肺癌發病率明顯上升，病死率較高，在早中期采用以手術切除為主的綜合治療療效較好。但肺癌根治術后患者身體受打擊較大，免疫功能顯著下降，不利于患者的康復，且不利于術后的放化療等輔助治療，故提高患者術后免疫功能顯得極其重要[1,2]。目前有臨床研究將補中益氣湯應用于肺癌肺葉切除術后，療效良好[2,3]，但其免疫調節水平及其應用療程尚未明確，且對肺癌切除患者T細胞水平影響的相關報道極少。2015年1月～2017年1月，本研究觀察了補中益氣湯灌胃對右下肺癌肺葉切除術后大鼠T細胞水平的影響，為補中益氣湯的臨床應用提供有力的基礎研究證據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑及儀器 Wistar大鼠80只，均為雄性，鼠齡4～6個月。主要試劑：T細胞亞群免疫組化試劑盒(北京賽馳生物科技有限公司)，三甲基膽蒽(MCA)，二乙基亞硝胺(DEN)，乙醚，鹽酸氯胺酮注射液，超液化碘油等。實驗儀器：BD FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)，LDZ5-2型低速自動平衡離心機(北京醫用離心機廠)，3D數字化三維成像全景X光機(美國GE公司)。

1.2 補中益氣湯配置 補中益氣湯處方組成及配置按廣州中醫藥大學第一附屬醫院藥劑中心標準。成分有黃芪60 g，白術15 g，人參10 g，柴胡10 g，當歸10 g，炙甘草10 g，廣升麻10 g，陳皮10 g。劑型：每1劑水煎至200 mL，分裝成每袋100 mL備用。

1.3 右下肺鱗癌模型建立及動物分組、處理 首先制備致癌劑：將10 mL碘油、1 mL DEN、750 mg MCA混和后，置于70 ℃水浴箱過夜(整個過程密封)。成功判斷標準：在碘油里看不到固體粉末，為混懸液。按文獻[4]方法制備大鼠右下肺鱗癌模型，在內鏡下向大鼠右下支氣管內灌注致癌劑。灌藥后即刻、3個月、6個月接受X線體層攝影檢查，并在造模6～8個月后查X線體層攝影篩選。成功造模者可見右下肺野塊狀或結節狀陰影；并對隨后的右下肺葉切除術標本進一步病理確診。成功建立大鼠右下肺癌模型66只，取60只進行本研究，將其隨機分為實驗組及對照組各30只。腹腔注射0.5%異戊巴比妥鈉(0.3 mL/20 g)麻醉各組大鼠，行右下肺葉切除；術后右胸腔閉式引流，胸水<10 mL/24 h時拔除胸管。自術后次日實驗組每日晨9:00經口給予補中益氣湯灌胃，100 mL/(kg·d)；對照組等量生理鹽水灌胃。

1.4 外周血T細胞水平檢測 采用流式細胞儀檢測。右下肺葉切除術中取各組右下肺血管內不凝血50 μL作為術前血。術后第3、7、14天分別處死實驗組、對照組10只大鼠，處死時取大鼠眼眶靜脈不凝血50 μL。取抗凝全血50 μL，室溫放置15 min后加入適量紅細胞溶解液，溶血后去除紅細胞；加入5 μL CD3+、5 μL CD4+和5 μL CD8+單克隆抗體于離心管中混勻；室溫避光15 min；1 000 r/min離心1.5 min；倒去上清液，加入500 μL PBS液，輕輕搖蕩10 min。用流式細胞儀檢測CD3+、CD4+、CD8+T細胞水平，并計算CD4+/CD8+。

2 結果

各組外周血T細胞水平比較見表1。

表1 各組外周血T細胞水平比較

注：與本組術前相比，*P<0.05；與本組術后第3天相比，#P<0.05；與本組術后同時點相比，△P<0.05；與對照組術后第7天相比，▲P<0.05。

3 討論

一般情況下手術后免疫功能將減弱，許多學者認為CD3+、CD4+、CD8+T細胞水平和CD4+/CD8+可以作為衡量圍手術期細胞免疫功能的主要指標。CD3+、CD4+T細胞的作用是促進免疫應答,而CD8+T細胞可抑制免疫應答[5～7]。

補中益氣湯方是李東垣根據《素問·至真要大論》“損者益之,勞者溫之”的宗旨而制定，為補中益氣、升陽舉陷、甘溫除大熱的代表方,由黃芪、炙甘草、人參、白術、當歸、陳皮、柴胡、升麻等組成。黃芪味甘微溫，入脾、肺經，補中益氣,升陽固表為君藥；輔以炙甘草、人參、白術益氣健脾,助黃芪增強補中益氣之功而為臣藥；血為氣之母，氣虛時久，營血亦虧，故用當歸養血和營,助參芪以補氣生血；配陳皮理氣和胃,使諸藥補而不滯；用少量升麻、柴胡,助主藥以升提中氣、升陽舉陷；炙甘草調和諸藥，共為佐使。用于治療中氣下陷、脾胃虛弱、氣虛發熱、氣粗而喘等癥[8,9]。現代藥理研究[10,11]表明,補中益氣湯可以綜合性地提高機體免疫力,促進抗體產生,延長抗體作用時間。黃芪具有促血管生成作用,并有一定的造血功能[12]。黃芪多糖、人參皂苷、白術等通過抑制抑制性T細胞，使其他T細胞亞群如輔助性T細胞的功能得以增強，使T細胞分化成熟，并顯著提高其活性并促進新陳代謝[8,11]。

肺癌患者接受肺葉切除術后由于手術創傷、失血、食欲下降、肺部炎癥、肺容量減少和麻醉反應等，在術后初期免疫功能大都進一步明顯下降，反映免疫功能的T細胞水平將出現波動，表現為CD3+、CD4+T細胞水平和CD4+/CD8+下降、CD8+T細胞水平升高；隨著術后康復，CD3+、CD4+T細胞水平及CD4+/CD8+逐漸回升至術前水平或超過術前水平[5,6,13]。董經光等[6]指出肺癌患者術前CD3+、CD4+T細胞水平和CD4+/CD8+低于肺良性腫瘤患者和對照者,而CD8+T細胞水平高于肺良性腫瘤患者和對照者；肺癌患者術后第1天的CD3+、CD4+T細胞水平及CD4+/CD8+較術前降低,而CD8+T細胞水平升高；術后第7～14天,上述各項指標基本恢復到術前水平；術后第21天,CD3+、CD4+T細胞水平及CD4+/CD8+均較術前升高，而CD8+T細胞水平顯著降低。本研究各組術前T細胞水平比較無明顯差異，說明兩組實驗前免疫狀況基本一致。本研究結果表明，與術前T細胞水平比較，實驗組和對照組術后第3天CD3+、CD4+T細胞水平及CD4+/CD8+均低，CD8+T細胞水平高，且兩組術后比較差異無統計學意義，說明術后第3天兩組的免疫功能因為手術打擊都未能恢復至術前水平，且補中益氣湯尚未能充分發揮出免疫調節作用。本研究結果表明，與術前T細胞水平比較，實驗組術后第7天CD3+、CD4+T細胞水平及CD4+/CD8+高，CD8+T細胞水平低，對照組無明顯差異，且實驗組波動幅度大于對照組，說明術后第7天兩組的免疫功能逐步康復，且補中益氣湯充分發揮了細胞免疫調節作用。本研究結果表明，實驗組、對照組術后第14天的T細胞水平與術前比較均有改善，但兩組比較無統計學差異，說明術后第14天大鼠發揮了自主免疫調節功能，與是否應用補中益氣湯已經無明顯關系。本研究結果表明，實驗組術后第3、7、14天CD3+、CD4+、CD8+T細胞水平及CD4+/CD8+兩兩相比均有統計學差異，對照組術后第3、7、14天CD3+、CD4+、CD8+T細胞水平及CD4+/CD8+兩兩相比均有統計學差異，說明兩組術后14 d內T細胞免疫功能逐步改善。可見，補中益氣湯灌胃可提高右下肺癌肺葉切除術后大鼠CD3+、CD4+T細胞水平及CD4+/CD8+，并降低CD8+T細胞水平。

[1] 趙順，曲珊，明茗，等.早期營養干預對肺癌術后患者免疫功能及生活質量的影響[J].山西醫藥雜志,2016,45(20):2401-2404.

[2] 李小海，楊弘，王建，等.加味補中益氣湯對肺癌術后化療效果的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2016,32(8):48-51.

[3] 朱潔，張旭，葉麗紅.中醫益氣法治療肺癌探析[J].遼寧中醫藥大學學報,2014,16(1):80-82.

[4] 楊廷桐,方卓寧,張付美,等.大鼠肺鱗癌模型的建立[J].動物醫學進展,2009,30(4):27-30.

[5] 黃向業，趙靜，張茜，等.圍手術期T淋巴細胞影響因素的研究進展[J].山東醫藥,2014,54(44):98-100.

[6] 董經光,宋偉,江昆,等.肺癌患者圍術期外周血T淋巴細胞亞群的變化[J].山東醫藥,2010,50(26):68-69.

[7] Sawant A, Schafer CC, Jin TH, et al. Enhancement of antitumor immunity in lung cancer by targeting myeloid-derived suppressor cell pathways[J]. Cancer Res, 2013,73(22): 6609-6620.

[8] 鄧淙友.補中益氣湯及其配伍的藥效學研究[D].廣州：廣州中醫藥大學,2012.

[9] 施旭光，吳美音，黃曼婷，等.基于代謝組學的補中益氣湯“益氣升陽”配伍機制研究[J].中國實驗方劑學雜志,2014,20(1):103-106.

[10] 樊慧杰，柴智，閆潤紅，等.補中益氣湯對脾氣虛證模型大鼠手術切口肌肉組織炎癥反應和肉芽組織增生的影響[J].中醫雜志,2014,55(3):238-241.

[11] 王閩予.基于藥效及代謝組學的補中益氣湯“益氣升陽”配伍研究[D].廣州：廣州中醫藥大學,2013.

[12] 劉珂，邱炳勛，鄒利，等.黃芪及其有效成分對內皮細胞及其連接的保護作用及機制研究進展[J].中草藥,2016,47(21):3912-3917.

[13] 鄒靜,劉斌,陳雪華,等.肺癌患者外周血T淋巴細胞亞群變化特點及臨床意義[J].中國免疫學雜志,2010,26(11):1016-1020.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.38.011

R734.2

A

1002-266X(2017)38-0038-03

廣東省中醫藥管理局基金資助項目(20141119)。

2017-04-04)