耐藥肝癌細胞p62表達與順鉑敏感性的關系

鄭志明，鄒海鵬，林碧華，龍冰清

(1中山市小欖人民醫院，廣東中山528415；2濱州醫學院煙臺附屬醫院；3廣東醫科大學生物化學與分子生物學教研室；4廣東省醫學分子診斷重點實驗室)

·論著·

耐藥肝癌細胞p62表達與順鉑敏感性的關系

鄭志明1，鄒海鵬2，林碧華3,4，龍冰清1

(1中山市小欖人民醫院，廣東中山528415；2濱州醫學院煙臺附屬醫院；3廣東醫科大學生物化學與分子生物學教研室；4廣東省醫學分子診斷重點實驗室)

目的觀察順鉑耐藥的肝癌細胞中p62的表達情況，及p62基因沉默后耐藥肝癌細胞對順鉑敏感性的變化。方法培養肝癌親本細胞HepG2、Huh7，通過濃度梯度法建立順鉑耐藥細胞模型，采用Western blotting法檢測親本HepG2、Huh7細胞和耐藥HepG2、Huh7細胞中的p62蛋白。將耐藥HepG2、Huh7細胞分為沉默組和耐藥組，分別轉染p62 siRNA和siRNA Negative Control。在轉染48 h后的0、1、2、3、4、5 d測算沉默組和耐藥組細胞存活率。轉染后48 h進行Hochest 33258染色觀察沉默組和耐藥組細胞凋亡核形態、計數凋亡細胞，采用Annexin V-FITC/PI流式細胞術測算細胞凋亡率。轉染后48 h采用Western blotting法檢測沉默組與耐藥組細胞中的核因子紅細胞前體2相關因子2(Nrf2)，RT-PCR法檢測Nrf2蛋白下游的谷氨酸半胱氨酸合成酶(GCL)、谷胱甘肽S轉移酶(GST)、NADP(H)醌氧化還原酶(NQO1)、血紅素氧化酶1(HO-1)、多藥耐藥蛋白(Mrp)基因。結果耐藥的HepG2、Huh7細胞中p62蛋白相對表達量分別高于親本HepG2、Huh7細胞(P均<0.05)。轉染48 h后的0、1、2、3、4、5 d沉默組HepG2、Huh7細胞存活率低于耐藥組(P均<0.05)。沉默組凋亡細胞數及凋亡率均高于耐藥組(P均<0.05)。沉默組細胞中Nrf2蛋白及NQO1、GCL、GST、HO-1、Mrp mRNA相對表達量均低于耐藥組(P均<0.05)。結論順鉑耐藥的肝癌細胞中p62蛋白表達上調；p62基因沉默后耐藥肝癌細胞對順鉑的敏感性增強，其機制可能與Nrf2及其下游基因表達下調有關。

肝癌；肝癌細胞；耐藥；順鉑；p62；基因沉默；核因子紅細胞前體2相關因子2

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一[1]，中國是肝癌高發國家，肝癌發病率占世界總數的50.5%，病死率占世界總數的51.4%[2]。肝癌惡性程度高，易復發和轉移，遠期療效并不理想[3]。化療是治療肝癌的最主要方法之一，但化療藥物耐藥問題成為肝癌治療的瓶頸[4]。尋找肝癌化療耐藥的關鍵調控因子，闡明耐藥作用機制，對肝癌的治療具有重要意義。p62是一種多功能泛素化接頭蛋白，最早被發現在細胞自噬調節中發揮重要作用[5]。近年來研究表明，p62在多種腫瘤中異常表達，如肝癌[6]、胃癌[7]、肺癌[8]、結腸癌[9]、乳腺癌[10]等，廣泛參與腫瘤細胞的增殖、分化、抗凋亡等過程，與腫瘤患者的不良預后顯著相關[11,12]。目前關于p62與肝癌細胞耐藥性的關系報道較少。本研究觀察了順鉑耐藥的肝癌細胞中p62的表達情況，選擇p62基準值相對較低的順鉑耐藥肝癌細胞株HepG2和Huh7，以細胞存活率、細胞凋亡率和耐藥相關基因表達作為化療敏感性的指標，觀察p62基因沉默后耐藥肝癌細胞對順鉑敏感性的變化，并探討其相關機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要實驗材料 人肝癌細胞株HepG2和Huh7均來源于中國科學院上海細胞庫，由本實驗室規范培養保存。順鉑耐藥肝癌細胞株是本課題組前期經過3個月小劑量濃度梯度法誘導建立而成，培養過程中重復測定其耐藥性，經凍存再復蘇后耐藥性質穩定。順鉑購自Selleck公司。RPMI-1640培養基、Opti-MEM培養基、胎牛血清(FBS)、0.05%胰蛋白酶液、Lipofectamine3000轉染試劑、TRIzol試劑購自Thermofisher Scientific公司。Anti-SQSTM1/p62小鼠單克隆抗體(ab56416)、anti-核因子紅細胞前體2相關因子2(Nrf2)兔單克隆抗體(ab62352)、anti-p84兔單克隆抗體(ab131268)購自Abcam公司。anti-α-tubulin兔多克隆抗體(11224-1-AP)購自Proteintech Group公司。p62 siRNA片段及對應的siRNA Negative Control購自Invitrogen公司。Hoechest33258購自阿拉丁公司。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司。MTT購自鼎國昌盛生物技術公司。逆轉錄試劑盒及SYBR Green定量PCR試劑盒購自Roche公司。酶標儀為Biotek公司產品。CFX96實時熒光定量PCR儀為Bio-Rad公司產品。Gallios流式細胞儀為Beckman Coulter公司產品。

1.2 順鉑耐藥肝癌細胞模型建立及p62蛋白檢測

電子文檔由于創新性比較強，其保存過程中一定要注意其密級的界定，很多研究檔案或者研究數據在投放市場涉及科研機密，管理人員要及時與資源生產者聯系，確定使用范圍以及保密期限，方便電子文檔的使用。①對電子文檔使用范圍進行界定，哪些電子文檔資源是可以在本校使用的，哪些是可以在行業內進行共享的，都需要與資源擁有者進行協商。②涉及館外人員的電子文檔，在保存和使用中要與當事人進行協商，界定可使用的范圍，一方面要盡量保護讀者的權益的同時，也要盡量的保證電子文檔社會效益的發揮。

1.2.1 耐藥細胞模型建立 人肝癌親本細胞HepG2和Huh7用含10%FBS、1%青霉素+鏈霉素和1%谷氨酰胺的RPMI-1640培養液培養。采用濃度梯度法誘導順鉑耐藥的肝癌細胞：用初始順鉑濃度0.1 μg/mL處理細胞后，可觀察細胞生長緩慢，形態衰老，繼續培養至出現新的克隆，使其在0.1 μg/mL順鉑環境中穩定生長，傳代2次后將順鉑濃度提升至0.15 μg/mL；重復上述步驟，梯度提高順鉑濃度至細胞能在1 μg/mL順鉑環境中穩定生長，總誘導時間為3個月。耐藥細胞在1 μg/mL順鉑環境下，放入37.0 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養箱中培養。

超微粉碎技術對靈芝中三萜類成分溶出的影響…………………………………………………… 張福君等（5）：599

1.3 p62基因沉默的耐藥肝癌細胞對順鉑敏感性觀察

2.3 沉默組與耐藥組凋亡細胞數及凋亡率比較 沉默組細胞出現明顯細胞核固縮碎裂，染色質凝集，呈大小不等碎塊狀濃染，耐藥組細胞核形態清晰，進行正常細胞有絲分裂。沉默組凋亡細胞數及凋亡率均高于耐藥組(P均<0.05)。詳見表3。

2.1 耐藥肝癌細胞中p62蛋白的表達變化 親本HepG2細胞及耐藥HepG2細胞中p62蛋白相對表達量分別為0.25±0.05、0.58±0.16，親本Huh7細胞及耐藥Huh7細胞中p62蛋白相對表達量分別為0.22±0.04、0.52±0.11，耐藥的HepG2、Huh7細胞中p62蛋白相對表達量分別高于親本HepG2、Huh7細胞(P均<0.05)。

用于評估被試參加團輔的主觀感受，共包括4個開放式題目，分別是參加團輔后情緒變化、對團輔內容的評價、對自我的認識、對本次團輔的建議.在團輔結束時進行集體施測，當場回收.

1.3.4 Nrf2蛋白及其下游靶基因檢測 轉染48 h后，采用Western blotting法檢測Nrf2蛋白。將HepG2、Huh7耐藥組和沉默組細胞用1×PBS洗2次，加入RIPA細胞裂解液冰上裂解10 min，4 ℃下12 000 g離心，收集上清，按BCA蛋白定量試劑盒說明書進行蛋白定量，加入蛋白變性劑后沸水浴變性蛋白。各組樣品上樣量為30 μg，使用SDS-PAGE蛋白電泳系統分離蛋白，電濕轉法將蛋白轉移至0.2 μm的PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉后，加入稀釋的一抗工作液(Anti-SQSTM1/p62小鼠單克隆抗體)，4 ℃孵育過夜，1×TBST漂洗3次。加入稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗工作液，室溫孵育1 h，1×TBST漂洗。滴加新鮮配置的ECL化學發光液，在暗室中曝光顯影。用Photoshop軟件分析得到目的條帶與內參條帶的灰度值，將二者比值作為目的蛋白的相對表達量。采用RT-PCR法檢測兩組細胞中的谷氨酸半胱氨酸合成酶(GCL)、谷胱甘肽S轉移酶(GST)、NADP(H)醌氧化還原酶(NQO1)、血紅素氧化酶1(HO-1)、多藥耐藥蛋白(Mrp)基因。收集沉默組與耐藥組細胞，加入1 mL的TRIzol試劑裂解細胞，采用氯仿萃取異丙醇沉淀提取總RNA。隨后按PrimeScript RT reagent Kit說明書操作，將RNA逆轉錄為cDNA；按SYBR Premix Ex Taq Ⅱ Kit說明書操作，GAPDH為內參(引物信息見表1)；在CFX96實時定量PCR系統上進行PCR反應；以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。

表1 Nrf2下游靶基因及內參基因引物序列

1.2.2 p62蛋白檢測 采用Western blotting法檢測p62蛋白。將HepG2、Huh7細胞及對順鉑耐藥的HepG2、Huh7細胞用1×PBS洗兩次，加入RIPA細胞裂解液(150 mmol/L NaCl、1% NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉、0.2%SDS、2%甘油)冰上裂解10 min，4 ℃下12 000 g離心，收集上清，按BCA蛋白定量試劑盒說明書進行蛋白定量，加入蛋白變性劑后沸水浴變性蛋白。各組樣品上樣量為30 μg，使用SDS-PAGE蛋白電泳系統分離蛋白，電濕轉法將蛋白轉移至0.2 μm的PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉后，加入稀釋的一抗工作液(Anti-SQSTM1/p62小鼠單克隆抗體)，4 ℃孵育過夜，1×TBST漂洗3次。加入稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗工作液，室溫孵育1 h，1×TBST漂洗。滴加新鮮配置的ECL化學發光液，在暗室中曝光顯影。用Photoshop軟件分析得到目的條帶與內參條帶的灰度值，將二者比值作為目的蛋白的相對表達量。

但事實卻是，想象和現實之間總存在著巨大的鴻溝。在擺弄過奧迪R8 RWS之后，勞拉表示：“它動力強勁，但也一定程度上導致了轉向過度。當出現轉向過度的傾向時，發動機的輸出會有些不太受控制，這一點和普通的奧迪R8完全不同。”另一點在于，降擋之后，那臺V10發動機的轉速會突然飆升，導致車尾在制動的過程中會突然喪失下壓力，進一步增加了轉向不足的概率。

2 結果

1.3.2 細胞存活率測算 轉染48 h后，利用MTT法檢測細胞存活情況。將沉默組和耐藥組細胞消化后接種于96孔培養板中(200 μL，1×103個細胞)，全過程用添加順鉑的培養基培養，次日開始每天(共5 d)觀察兩組細胞的存活情況。具體方法：每組設置3個復孔，加入20 μL的MTT，繼續培養細胞4 h后加入160 μL的DMSO(選擇一個空白孔加入160 μL的DMSO作為空白對照)；酶標儀上490 nm波長處測定光密度值(OD值)，根據結果繪制細胞生存曲線。根據公式計算細胞存活率：細胞存活率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

2.2 沉默組與耐藥組細胞存活率比較 轉染48 h后的0、1、2、3、4、5 d沉默組HepG2、Huh7細胞存活率低于耐藥組(P均<0.05)。見圖1、表2。

1.3.1 p62基因沉默方法 將耐藥的HepG2、Huh7細胞分為耐藥組和沉默組。待細胞生長至指數增殖階段(密度為60%～70%)進行轉染，更換新的完全培養基。用Lipofectamine3000試劑進行轉染，沉默組轉染p62 siRNA(終濃度100 nmol/L)，耐藥組轉染siRNA Negative Control(終濃度100 nmol/L)。將細胞放于培養箱中繼續培養，轉染48 h時進行后續實驗。

1.3.3 凋亡細胞觀察及凋亡率測算 采用Hochest33258染色法觀察細胞凋亡情況。將沉默組和耐藥組細胞消化后接種于24孔培養板中(1 mL，6×104個細胞，板中事先鋪好細胞爬片)，培養過夜后棄除培養基，4%多聚甲醛固定細胞10 min，去除固定液，1×PBS洗兩次；加入0.5 mg/L的Hoechest33258染液避光室溫染色20 min，1×PBS洗兩次，避光風干；倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，視野中隨機選取5個視野，計數凋亡細胞(細胞核固縮碎裂，染色質凝集，呈大小不等碎塊狀濃染)。將沉默組與耐藥組細胞消化后離心棄上清，1×PBS洗兩次，按每孔106個細胞加入500 μL的Binding buffer充分重懸細胞，加入5 μL的Annexin V-FITC染液混勻，室溫避光孵育10 min，再加入10 μL的PI染液混勻后避光孵育5 min，1 h內上流式細胞分析儀測算兩組細胞凋亡率。

圖1 轉染后0～5 d沉默組與耐藥組細胞存活率

2.4 沉默組與耐藥組細胞中Nrf2蛋白及其下游靶基因表達比較 沉默組細胞中Nrf2蛋白及NQO1、GCL、GST、HO-1、Mrp mRNA相對表達量均低于耐藥組(P均<0.05)。詳見表4。

3 討論

肝癌是中國最常見的惡性腫瘤之一[2]，常規治療方法為手術切除，但其術后復發率高，且晚期肝癌患者不能進行手術，因此化療是目前治療復發肝癌及晚期肝癌的首選方案[13～16]。然而，大量臨床實踐p62攜帶多個功能結構域，是調控多個信號轉導通路的關鍵節點，如N端的PB1區域能夠使其自身寡聚化及多聚化[18]，ZZ鋅指結構可與NF-κB通路關鍵蛋白相互作用[19]，TBS序列能夠與TRAF6結合調控炎癥反應[20]，C端的UBA結構域能夠與泛素化蛋白相互作用從而促進自噬途徑降解過程[21]。p62的這些結構域決定了其功能的多樣性，主要涉及細胞存活、凋亡、選擇性自噬等方面。因此，探討p62在不同模型中的功能及其作用機制具有重要意義。本研究成功構建了對順鉑耐藥的肝癌細胞系，發現相對于親本細胞，耐藥細胞中p62蛋白高表達，預示p62在肝癌耐藥性中可能發揮關鍵作用。進一步研究發現，轉染48 h后的0、1、2、3、4、5 d 檢測細胞存活率，發現沉默組HepG2、Huh7細胞存活率低于耐藥組細胞，沉默組凋亡細胞數及凋亡率均高于耐藥組細胞，提示干擾p62能夠增強耐藥肝癌細胞對順鉑的敏感性，意味著p62可能在順鉑誘導耐藥過程中發揮核心作用，參與肝癌耐藥性的產生。

表2 轉染48 h后0～5 d沉默組與耐藥組細胞存活率比較

注：與耐藥組同類細胞相比，*P<0.05。

表3 沉默組與耐藥組凋亡細胞數及凋亡率比較

注：與耐藥組同類細胞相比，*P<0.05。表明肝癌細胞具有強耐藥性，嚴重影響化療效果[17]。因此，深入探究肝癌細胞耐藥的分子機制，尋找耐藥相關的治療靶點是目前研究的熱點和難點。

表4 沉默組與耐藥組細胞中Nrf2蛋白及其下游靶基因表達比較

注：與耐藥組同類細胞相比，*P<0.05。

Nrf2是一個與腫瘤耐藥相關的重要轉錄因子，通過激活腫瘤細胞的抗氧化應答和誘導一系列抗氧化基因轉錄，從而對抗化療藥物在氧化應激過程中產生的有害物質，起到保護腫瘤細胞的作用[15,22,23]。目前認為受Nrf2調控的靶基因主要有三類：細胞內氧化還原平衡蛋白如GCL和GST，第Ⅱ相解毒酶如NQO1和GST，ATP依賴性耐藥泵基因如Mrps等[22～24]。研究表明，p62在細胞中的作用機制可能與其調節轉錄因子Nfr2表達有關。而Nrf2被報道通過轉錄激活下游基因的表達，參與腫瘤細胞耐藥[14,15]。所以我們推測，p62對肝癌細胞耐藥性的作用可能是通過調控Nrf2的表達實現的。本研究結果顯示，沉默組細胞中Nrf2蛋白及NQO1、GCL、GST、HO-1、Mrp mRNA相對表達量均低于耐藥組，推測p62參與肝癌細胞耐藥可能與調控Nrf2及其下游基因表達有關。有研究表明p62的KIR結構域能與Keap1的Kelch結構域結合，阻斷Keap1與Nrf2的相互作用，促使Keap1經自噬降解，從而激活Nrf2[13]。關于本研究中p62具體是通過何種機制調控Nrf2，目前的數據不足以說明此機制，還有待進一步深入研究來證實。

教師的歷史教學能力，不僅表現在對歷史事件與觀點講述上，還體現在對歷史事件與觀點的論證上。信息技術的發展，便于學生更好的獲取歷史信息，使學生能夠接觸大量的歷史事件與觀點。在此背景下，教師在完成教授學生主流歷史觀點任務后，還應該提升自身歷史論證能力。而教師收集、選取史料中，事實上就是分析、總結歷史教材，是提升教師歷史論證能力的過程。在歷史教學中，教師有效的運用史料教學，能夠體現歷史教學的魅力，并且還能夠提升歷史教學質量，從而使學生學習到全面的歷史知識。

綜上所述，順鉑耐藥的肝癌細胞中p62蛋白表達上調；p62基因沉默后耐藥肝癌細胞對順鉑的敏感性增強，其機制可能與Nrf2及其下游基因表達下調有關。p62可能成為逆轉肝癌細胞順鉑耐藥的一個新的潛在靶點。

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Relationshipbetweenp62expressionincisplatin-resistantlivercancercellsandsensitivitytocisplatin

ZHENGZhiming1,ZOUHaipeng,LINBihua,LONGBingqing

(1XiaolanPeople′sHospitalofZhongshan,Zhongshan528415,China)

ObjectiveTo investigate the expression of p62 in cisplatin-resistant liver cancer cells and the chemotherapeutic sensitivity of p62-silenced cisplatin-resistant liver cancer cells to cisplatin.MethodsHuman liver cancer cell lines HepG2 and Huh7 were used to induce cisplatin-resistant cell lines by slowly increasing cisplatin concentrations. The protein expression of p62 was detected in parental cells and cisplatin-resistant cells by Western blotting. The liver cancer cisplatin-resistant cell lines (HepG2/CDDP and Huh7/CDDP) were divided into the p62-silenced group and cisplatin-resistant group, and were treated by p62 siRNA and siRNA Negative Controls, respectively. After 48-hour transfection, MTT assay was applied to detect cell viability of the two groups at 0, 1, 2, 3, 4, and 5 d. Apoptotic nuclear changes were evaluated with Hochest 33258 staining, and apoptotic cells were quantified. Meanwhile, the apoptosis rate was calculated by Annexin V-FITC/PI flow cytometry at 48 h after transfection. The protein expression of NF-E2-related factor 2 (Nrf2) and the mRNA expression of its target genes glutamate cysteine ligase (GCL), glutathione S transferase (GST), quinone oxidoreductase 1 (NQO1), glutathione S transferase (GST), heme oxygenase-1(HQ-1) and multidrug resistance-associated protein (Mrp) was evaluated by Western blotting and RT-PCR, respectively.ResultsThe cisplatin-resistant cells (HepG2 and Huh7) expressed much higher protein levels of p62 than their parental cells (allP<0.05). The cell viability of the two groups at 0, 1, 2, 3, 4, and 5 d of the p62-silenced group was lower than that of the cisplatin-resistant cells (allP<0.05), and the apoptosis of cisplatin-resistant group increased as compared with that of the p62-silenced group (allP<0.05). The expression of Nrf2 protein and its target genes NQO1, GCL, GST, HO-1, and Mrp mRNA of the p62-silenced group was lower than that of the cisplatin-resistant group (allP<0.05).ConclusionsThe protein level of p62 is up-regulated in cisplatin-resistant liver cancer cells. Silencing p62 increases the sensitivity of liver cancer cells to cisplatin by down-regulating the expression of Nrf2 and its target genes.

liver carcinoma; liver cancer cells; drug resistance; cisplatin; p62; gene silencing; NF-E2-related factor 2

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.39.001

R735.7

A

1002-266X(2017)39-0001-05

國家自然科學基金項目(81272434)；廣東省醫學科研基金項目(A2016395)；廣東省中醫藥局科研項目(20172085)；中山市科技計劃項目(2015B1061)。

鄭志明(1988-)，男，碩士，臨床藥師，主要研究方向為臨床藥學。E-mail: zhiyu06224@163.com

龍冰清(1985-)，女，本科，藥師，主要研究方向為臨床藥學。E-mail: zzm06224@yeah.net

2017-06-29)