CYP450、GSTs、UGT基因多態性與抗結核藥物肝損傷的關系

孫淑豐，李標，崇英之，杜瑩

(華北理工大學，河北唐山063210)

CYP450、GSTs、UGT基因多態性與抗結核藥物肝損傷的關系

孫淑豐，李標，崇英之，杜瑩

(華北理工大學，河北唐山063210)

目的探討細胞色素P450(CYP450)、谷胱甘肽轉移酶(GSTs)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶(UGT)基因多態性及其交互作用與抗結核藥物性肝損傷(ADLI)發生的關系。方法選擇接受抗結核化療6個月內出現肝損傷的漢族結核病患者207例納入病例組，以同期治療中未出現肝功能異常的結核病患者207例為對照組。采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性法觀察CYP1A2 734C/A、CYP3A4 18B-20232G/A、CYP3A5 3-6986A/G、CYP2C19 681G/A、GSTA1 -69C/T、GSTM3缺失突變、UGT2B7-268A/G、UGT2B7 802C/T位點的多態性。采用單因素、多因素Logistics回歸分析法分析CYP450、GSTs、UGT基因多態性與ADLI發生的關系。采用多因子降維法分析CYP450、GSTs、UGT基因多態性位點之間的交互作用與ADLI發生的關系。結果CYP1A2 734C/A的AA基因型、CYP3A4 18B-20232G/A的GA基因型、UGT2B7 -268A/G的AG基因型、UGT2B7 802C/T的TT基因型是ADLI的保護基因型，而CYP3A5 3-6986A/G的AG及GG基因型、GSTA1 -69C/T的TT基因型則是ADLI的危險基因型。調整其他基因多態性的影響后，發現CYP3A4*18B -20232G/A、CYP3A5*3 -6986A/G、UGT2B7 -268A/G和UGT2B7 802C/T位點基因多態性與ADLI的發生有關。多因子降維法分析得到UGT2B7 -268A/G、CYP3A4 18B-20232G、CYP3A5 3-6986G組成的3因素模型為最佳模型，檢驗樣本準確度為61.29%，交叉驗證一致性為10/10。最佳模型的估計結果顯示，與低危基因型組合相比，高危基因型組合顯著增加ADLI的發病風險。結論CYP3A4*18B-20232G/A、CYP3A5*3 -6986A/G、UGT2B7 -268A/G、UGT2B7 802C/T位點基因多態性與ADLI的發生有關，且基因位點之間存在交互作用，其中UGT2B7 -268A/G、CYP3A4 18B-20232G、CYP3A5 3-6986G組合將顯著增加ADLI的發生風險。

結核病；抗結核藥；藥物性肝損傷；藥物代謝酶；細胞色素P450；谷胱甘肽轉移酶；尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶；基因多態性

異煙肼、利福平和吡嗪酰胺等抗結核藥物引發的抗結核藥物性肝損傷(ADLI)發生率居藥物性肝損傷的首位[1,2]。既往研究表明，ADLI的發生存在明顯的個體差異，也是導致個體藥源性疾病風險升高的遺傳基礎之一。藥物在體內代謝需借助Ⅰ相代謝酶和Ⅱ相代謝酶的酶解作用。細胞色素P450(CYP)家族屬于Ⅰ相代謝酶，完成了體內60%以上藥物代謝毒物的清除，CYP家族基因CYP1A2、CYP2C19分別占肝臟藥物代謝酶的13%和20%[3]，二者與硫代乙酰胺、乙酰氨基酚、內皮素受體拮抗劑等藥物性肝損傷有關[4～6]，推測二者可能參與異煙肼代謝。谷胱甘肽轉移酶(GSTs)和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶(UGT)是參與藥物體內生物轉化與解毒過程的重要的Ⅱ相代謝酶。GSTA1、GSTM3是GSTs結合反應的關鍵酶。除UGT1A6、UGT1A7以外[7,8]，UGT2B7的基因多態性對藥物代謝也具有重要影響[9]。本研究旨在探討CYP1A2、CYP3A4、CYP3A5、CYP2C19、GSTA1、GSTM3、UGT2B7基因多態性及其交互作用與ADLI發生的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 研究對象選自2014年9月～2015年3月唐山市結核病醫院確診并接受規范抗結核治療的結核病患者。初治患者基本化療方案為2S(E)HRZ4HR(S為鏈霉素，E為乙胺丁醇，H為異煙肼，R為利福平，Z為吡嗪酰胺)，前2個月強化，后4個月鞏固，每日用藥。復治患者的基本化療方案為2S(E)HRZ4HR，隔日用藥。選擇治療前肝功能指標正常，隨訪6個月內出現肝損傷[10]且ALT高于正常值上限3倍的患者納入病例組，共207例。根據性別比例和城鄉居住地比例相同的原則，選擇隨訪6個月內肝功能未出現異常的207例患者納入對照組。排除合并可引起肝功能異常的其他疾病或服用其他能引起肝功能異常藥物的患者。

1.2 資料收集 收集兩組患者的年齡、性別、身高、體質量、婚姻情況、居住地、吸煙飲酒情況、文化程度、職業、既往疾病史及用藥情況、抗結核化療方案、歷次肝功能檢查結果等資料。收集EDTA抗凝靜脈血3 mL，-20 ℃凍存。

1.3 CYP450、GST、UGT基因多態性觀察 采用鹽析法提取兩組血細胞基因組DNA。根據文獻和基因庫中人類基因序列特性，用Primer Premier5.0軟件設計8個基因多態性位點(CYP1A2 734C/A、CYP3A4 18B-20232G/A、CYP3A5 3-6986A/G、CYP2C19 681G/A、GSTA1 -69C/T、GSTM3缺失突變、UGT2B7-268A/G、UGT2B7 802C/T)的引物。用聚合酶鏈反應—限制性片段長度多態性法觀察8個基因位點的多態性。以基因組DNA為模板，PCR反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸5 min。建立最優酶切體系，對PCR產物進行酶切分析。CYP1A2 734C/A上游引物序列為5′-CTACTCCAGCCCCAGAAGTG-3′，下游引物序列為5′-GAAGGGAACAGACTGG GACA-3′，Apa Ⅰ酶切。CYP3A4 18B-20232G/A上游引物序列為5′-CACCCTGATGTCCAGCAGAAACT-3′，下游引物序列為5′-AATAGAAAGCAGATGAACCAGAGAA-3′，Rsa Ⅰ酶切。CYP3A5 3-6986A/G上游引物序列為5′-CATGACTTAGT AGACAGATGAC-3′，下游引物序列為5′-GGTCCAAACAGGGAAGAGATA-3′，Ssp Ⅰ酶切。CYP2C19 681G/A上游引物序列為5′-CAACCAGAGCTTGGCATATT-3′，下游引物序列為5′-TACGCAAGGCAGTCACATAAC-3′，Sma Ⅰ酶切。GSTA1 -69C/T上游引物序列為5′-TGTTGATTGTTTGCCTGAAATT-3′，下游引物序列為5′-GTTAAACGCTGTCACCGTCCT-3′，Hinf Ⅰ酶切。GSTM3缺失突變上游引物序列為5′-ACCCTGCCAT CCTCAAGTGAA-3′，下游引物序列為5′-ATGCTTAGGTCTGAGGAGTAGTAGCCTGCAGAGATAGAGAAG-3′，BamH Ⅰ酶切。UGT2B7-268A/G上游引物序列為5′-TCCAACTGATTGTTATGGTAGAT-3′，下游引物序列為5′-GCTGTT CCTTTCTGTCATTTCTC-3′，BgI Ⅱ酶切。UGT2B7 802C/T上游引物序列為5′-GACAATGGGGAAAGC TGACG-3′，下游引物序列為5′-GTTTGGCAGGTTTGCAGTG-3′，BseG Ⅰ酶切。全部酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，與DNA分子量標準Marker為參照，紫外燈下觀察DNA條帶數量和分子量大小來判定結果。

1.4 統計學方法 全部數據錄入Excel2010數據表，進行整理核對。采用SPSS17.0軟件進行統計分析。基因型分布的Hardy-Weinberg遺傳平衡分析采用擬合優度檢驗。基因多態性與ADLI的關系采用單因素及多因素Logistics回歸法分析。基因多態性之間的交互作用分析采用多因子降維法(MDR)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 遺傳平衡性分析結果 Hardy Weinberg遺傳平衡定律檢驗結果發現觀察值與理論值近似。對照組的CYP1A2 734C/A、CYP3A4 18B-20232G/A、CYP3A5 3-6986A/G、CYP2C19 681G/A、GSTA1 -69C/T、GSTM3缺失突變、UGT2B7 -268A/G和UGT2B7 802C/T位點的檢驗結果χ2值分別為0.108、2.740、0.854、2.286、3.534、0.403、3.329和0.169，P均>0.05，提示對照人群處于平衡狀態，樣本人群代表性良好。

2.2 CYP450、GST、UGT基因多態性與ADLI發生的關系單因素分析結果 除性別、城鄉居住地兩個匹配因素外，兩組婚姻狀況(χ2=3.451，P=0.077)、文化程度(χ2=1.583，P=0.812)、職業(χ2=0.937，P=0.919)、體質量指數(χ2=1.561，P=0.435)、吸煙情況(χ2=0.060，P=0.841)、飲酒情況(χ2=0.296，P=0.580)差異無統計學意義，尚不能認為上述因素與ADLI的發生有關。非條件Logistics回歸分析結果顯示，病例組CYP1A2 734C/A的AA基因型、CYP3A4 18B-20232G/A的GA基因型、UGT2B7 -268A/G的AG基因型、UGT2B7 802C/T的TT基因型分布頻率高于對照組，CYP3A5 3-6986A/G的AG及GG基因型、GSTA1 -69C/T的TT基因型分布頻率低于對照組(P均<0.05)；CYP1A2 734C/A的AA基因型、CYP3A4 18B-20232G/A的GA基因型、UGT2B7 -268A/G的AG基因型、UGT2B7 802C/T的TT基因型是ADLI的保護基因型，而CYP3A5 3-6986A/G的AG及GG基因型、GSTA1 -69C/T的TT基因型則是ADLI的危險基因型。詳見表1～3。

表1 病例組與對照組CYP450基因多態性比較(例)

注：以CC基因型為參照，與對照組比較，*P<0.05，OR為0.460，95%CI為0.251～0.811；以GG基因型為參照，與對照組比較，#P<0.05，OR為0.570，95%CI為0.358～0.866；以AA基因型為參照，與對照組比較，△P<0.05，OR分別為4.317、7.120，95%CI分別為1.979～9.378、3.409～15.356。

表2 病例組與對照組GSTs基因多態性比較(例)

注：以CC基因型為參照，與對照組比較，*P<0.05，OR為1.765，95%CI為1.132～2.855。

表3 病例組與對照組UGT基因多態性比較(例)

注：以AA基因型為參照，與對照組比較，*P<0.05，OR為0.389，95%CI為0.245～0.588；以CC基因型為參照，與對照組比較，#P<0.05，OR為0.458，95%CI為0.234～0.834。

2.3 CYP450、GST、UGT基因多態性與ADLI發生的關系多因素分析結果 將單因素研究中有意義的危險因素引入多因素非條件Logistics回歸模型，因變量為服用抗結核藥后是否發生肝損傷，自變量為單一藥物代謝酶基因型，協變量為單因素分析中有統計學意義的其他藥物代謝酶基因型。結果顯示，在調整其他基因多態性的影響后，CYP3A4*18B -20232G/A、CYP3A5*3 -6986A/G、UGT2B7-268A/G和UGT2B7 802C/T位點基因多態性與ADLI的發生有關。詳見表4。

2.4 CYP450、GST、UGT基因多態性位點交互作用與ADLI發生的關系 采用MDR法分析8個單核苷酸多態性位點之間的交互作用，估計了所有2因素到8因素的交互作用模型，得到最佳交互作用模型為UGT2B7 -268A/G、CYP3A4 18B-20232G、CYP3A5 3-6986G組成的3因素模型。該模型的檢驗樣本準確度為61.29%，交叉驗證一致性為10/10，經1 000次置換檢驗差異有統計學意義(P<0.05)。最佳模型的估計結果顯示，與低危基因型組合相比，高危基因型組合顯著增加ADLI的發病風險。詳見表5。

表4 CYP450、GST、UGT基因多態性與ADLI發病的關系多因素分析結果

注：各基因位點均以等位基因型為參照。

表5 CYP450、GST、UGT基因多態性位點交互作用與ADLI發生的關系分析結果

3 討論

多數抗結核藥都需要肝臟的Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶的催化作用來完成其代謝轉化過程，如N-乙酰轉移酶-2、GSTs、CYP450、UGT等。各種酶的基因表達均存在遺傳多態性，酶基因突變可造成其表達活性改變，導致酶代謝藥物能力改變，從而影響其對藥物的解毒作用。

本研究發現，CYP3A4*18B -20232G/A、CYP3A5*3 -6986A/G、UGT2B7 -268A/G和UGT2B7 802C/T基因多態性與ADLI的發生有關；CYP1A2 734C/A的AA基因型、CYP3A4 18B-20232G/A的GA基因型、UGT2B7 -268A/G的AG基因型、UGT2B7 802C/T的TT基因型是ADLI的保護基因型，而CYP3A5 3-6986A/G的AG及GG基因型、GSTA1 -69C/T的TT基因型則是ADLI的危險基因型。進一步分析發現，多個基因中存在交互作用，由UGT2B7 -268A/G，CYP3A4 18B-20232G和CYP3A5 3-6986G組成的3因素最佳交互作用模型可增加ADLI的發病風險。

CYP450酶系是肝臟中參與藥物代謝過程的關鍵酶系，其活性變化與ADLI的發生有關[11]。CYP1A2、CYP2C19作為人體肝臟中重要的氧化還原酶，其活性受藥物、基因等多因素的影響。CYP2C19基因突變對自身酶活性的影響頗大，我國漢族人群最常見的突變發生在681G/A位點，但本研究中并沒有發現CYP2C19 681G/A位點的基因多態性與ADLI的發生有關，與Tang等[12]的研究結論基本一致。盡管種族不同，但該位點的遺傳易感性還是類似的，提示CYP2C19 681G/A位點的基因突變可能對ADLI發病的影響不大。CYP3A5和CYP3A4亦為CYP家族中的重要成員，在藥物代謝過程中發揮重要作用。研究表明，CYP3A5*3和CYP3A4*18B基因多態性可影響藥代動力學，根據CYP3A5基因型調整藥物劑量可減少肝移植患者排斥反應的發生率[13]。

GST是肝臟中參與藥物代謝過程的Ⅱ相代謝酶。國內外關于GSTM3與ADLI的研究并不多見。但對已有的GSTM家族與ADLI的關系，多項研究結論不一。如印度、中國臺北、中國大陸的研究結果顯示GSTM1基因多態性與ADLI的發生有關[14]，但在韓國及印度學者的研究中卻得到了相反的結論[15]。本研究尚未得出GSTA1、GSTM3基因多態性與ADLI的發生相關。

UGT是外源物質在生物體內進行Ⅱ相生物轉化最重要的代謝酶。UGT2B7主要表達于肝臟，與藥物解毒和代謝密切相關。UGT2B7基因編碼區和啟動子區存在高度遺傳多態性，是決定個體遺傳易感性的重要基礎。本研究發現UGT2B7 -268、802位點的基因多態性與ADLI的發生顯著相關，UGT2B7基因268位點突變型雜合子AG和802位點突變型純合子TT攜帶者發生ADLI的危險性明顯低于野生型攜帶者。

近年研究認為，疾病的發生涉及到多個遺傳位點多態性的聯合作用，即存在基因-基因交互作用。MDR法主要通過交叉檢驗和置換檢驗來評價交互因子的作用強度，再根據1/10檢驗樣本的平衡檢驗誤差、sign檢驗的結果及交叉驗證的準確度來篩選多變量間的最佳聯合作用模型。本研究計算得到的MDR最佳聯合作用模型為UGT2B7-268A/G、CYP3A4 18B-20232G、CYP3A5 3-6986G的交互作用模型，這也是首次在我國漢族結核病人群中發現以上基因位點之間的交互作用與ADLI的相關性。

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RelationshipsofCYP450,GSTs,andUGTgenepolymorphismswithanti-tuberculosisdrug-inducedliverinjury

SUNShufeng,LIBiao,CHONGYingzhi,DUYing

(NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063210,China)

ObjectiveTo investigate the correlations of drug metabolic enzymes cytochrome P450 (CYP450), glutathione S-transferases (GSTs), and uridine diphosphate glycosyltransferase (UGT) gene single nucleotide polymorphisms (SNPs) with anti-tuberculosis drug-induced liver injury (ADLI).MethodsWe selected 207 cases of Han tuberculosis (TB) patients who experienced liver injury within 6 months of anti-TB chemotherapy treatment as the case group and 207 cases of TB patients with no abnormal liver function as the control group. Polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) was employed to identify the SNPs of CYP1A2 734C/A, CYP3A4 18B-20232G/A, CYP3A5 3-6986A/G, CYP2C19 681G/A, GSTA1 -69C/T, and GSTM3 deletion mutation, and UGT2B7-268A/G and UGT2B7 802C/T. We adopted univariate and multivariate logistic regression methods to discuss the relationships of CYP450, GSTs, and UGT gene SNPs with ADLI. Multifactor dimensionality reduction (MDR) method was used to explore the interaction between ADLI and SNPs.ResultsUnivariate and multivariate logistic regression analysis showed that the genotype AA of CYP1A2 734C/A, the genotype GA of CYP3A4*18B-20232G/A, the genotype AG of UGT2B7-268A/G, and the genotype TT of UGT2B7 802C/T were the protective genotypes of ADLI, and the mutant genotypes AG and GG of CYP3A5*3-6986A/G and the genotype TT of GSTA1-69C/T were the risk genotypes of ADLI. After adjusting the effects of other gene SNPs, we found that CYP3A4*18B-20232G/A, CYP3A5*3-6986A/G, UGT2B7-268A/G, and UGT2B7 802C/T were related to the occurrence of ADLI. A best model consisted of three factors UGT2B7 -268A/G, CYP3A4 18B-20232G, and CYP3A5 3-6986G, with the sample accuracy of 61.29% and the cross-validation consistency of 10/10, was obtained by MDR, and the high risk genotype combination could increase risk of ADLI.ConclusionsCYP3A4*18B-20232G/A, CYP3A5*3-6986A/G, UGT2B7-268A/G, and UGT2B7 802C/T gene SNPs are related to the occurrence of ADLI. Multifactor dimensionality reduction analysis shows that there are gene-gene interactions and the combination of UGT2B7-268A/G, CYP3A4*18B-20232G/A, and CYP3A5*3-6986A/G can increase the risk of ADLI.

tuberculosis; anti-tuberculosis drugs; drug-induced liver injury; drug metabolic enzymes;cytochrome P450; glutathione S-transferases; uridine diphosphate glycosyltransferase; gene polymorphisms

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.39.002

R575

A

1002-266X(2017)39-0006-05

國家自然科學基金項目(81041096)。

孫淑豐(1965-)，女，本科，主要研究方向為疾病康復治療。E-mail: sunshufeng@126.com

2017-07-09)