雙益方劑及其有效成分對胰島素抵抗小鼠胰島β細胞株胰島素分泌、增殖、凋亡的影響

田春雨，馬雷雷,喇孝瑾

(華北理工大學，河北唐山063210)

雙益方劑及其有效成分對胰島素抵抗小鼠胰島β細胞株胰島素分泌、增殖、凋亡的影響

田春雨，馬雷雷,喇孝瑾

(華北理工大學，河北唐山063210)

目的觀察雙益方及其有效成分對胰島素抵抗的小鼠胰島β細胞株Min6胰島素分泌水平和細胞增殖、凋亡的影響，并探討其作用機制。方法培養Min6細胞并分為正常組、IR模型組、二甲雙胍組、雙益方組、雙益方組方單味中藥組(山茱萸、黃芪、黃連、葛根、桑白皮、佩蘭)及雙益方有效成分組(1-脫氧野尻霉素、小檗堿、黃芪甲苷、熊果酸、馬錢苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、葛根素)。正常組加入無酚紅培養液正常培養；其余各組加入葡萄糖和棕櫚酸制作胰島素抵抗的Min6細胞模型。二甲雙胍組加入100 μg/L的二甲雙胍。雙益方組、山茱萸組、黃芪組、黃連組、葛根組、桑白皮組、佩蘭組、葛根素組、1-脫氧野尻霉素組、小檗堿組、黃芪甲苷組、馬錢苷組、熊果酸組、毛蕊異黃酮葡萄糖苷組分別加入50、100、200 μg/L的相應藥物。各組于給藥24 h后進行胰島素分泌實驗，檢測胰島素分泌水平。各組分別于給藥24、48 h采用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖能力。于給藥24 h后采用雙染法檢測正常組、IR模型組、二甲雙胍組、雙益方組的凋亡細胞，計算細胞凋亡率；采用Western blotting法檢測細胞中的ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2蛋白。結果IR模型組細胞高糖、低糖刺激下胰島素分泌水平均低于正常組(P均<0.05)。二甲雙胍組、黃芪組、葛根組、雙益方組、黃芪甲苷組、山茱萸組、1-脫氧野尻霉素組、葛根素組、小檗堿組胰島素分泌水平高于IR模型組(P均<0.05)。IR模型組細胞增殖能力低于正常組(P均<0.05)；二甲雙胍組、雙益方組、黃芪組、黃芪甲苷組、1-脫氧野尻霉素組、山茱萸組細胞增殖能力高于IR模型組(P均<0.05)。IR模型組細胞凋亡率高于正常組，雙益方各組細胞凋亡率均低于IR模型組(P均<0.05)。IR模型組細胞中MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相對表達量低于正常組(P均<0.05)；二甲雙胍組及雙益方組細胞中MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相對表達量高于IR模型組(P均<0.05)。結論雙益方及其黃芪、葛根、黃芪甲苷、山茱萸、1-脫氧野尻霉素、葛根素、小檗堿等成分可有效提高胰島素抵抗的Min6細胞的胰島素分泌水平，促進細胞增殖并抑制其凋亡，作用機制可能與ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2蛋白表達上調有關。

雙益方；2型糖尿病；胰島素抵抗；胰島素分泌實驗；細胞增殖；細胞凋亡；小鼠胰島β細胞株

目前我國已成為世界上糖尿病患者人數最多的國家。研制安全有效、價格低廉的防治糖尿病的藥物已成為研究熱點和難點[1～4]。近年來中醫藥防治2型糖尿病取得了較大進展[5]。我們采用雙益方治療2型糖尿病取得了較好的調節糖代謝的效果。雙益方組分為黃芪、葛根、山茱萸、桑白皮、黃連、佩蘭，其有效成分可能包括1-脫氧野尻霉素、小檗堿、黃芪甲苷、熊果酸、馬錢苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、葛根素[6～9]，但該復方具體的作用機制還不明確。為此，本實驗建立了小鼠胰島β細胞株Min6胰島素抵抗(IR)模型，觀察雙益方及其有效成分對Min6細胞胰島素分泌水平和細胞增殖、凋亡的影響，為雙益方的開發利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 Min6細胞購于上海復旦大學細胞庫。DMEM培養基購于Gibco公司，胎牛血清購于GEMINI公司，雙硫腙(DTZ)購于上海伊卡生物公司；CCK-8試劑購于DOJINDO公司，胰島素分泌試劑盒購于Mercodia公司，Goat anti-rabbit、Anti-MEK1/2抗體、Anti-ERK1+ERK2 antibody購于ABCAM公司，Annexin V-FITC & PI細胞凋亡試劑盒購于Merckmillipore公司。M200PRO酶標儀(TECAN公司)，V3蛋白分析系統(Bio-Rad公司)。

1.2 細胞分組及IR模型制作 Min6細胞在含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素、β-硫基乙醇的DMEM培養液中恒溫培養。將Min6細胞以5×103/孔接種于96孔板，繼續培養24 h。將細胞分為正常組、IR模型組、二甲雙胍組、雙益方組、雙益方組方單味中藥組(山茱萸、黃芪、黃連、葛根、桑白皮、佩蘭)及雙益方有效成分組(1-脫氧野尻霉素、小檗堿、黃芪甲苷、熊果酸、馬錢苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、葛根素)。正常組加入無酚紅培養液100 μL正常培養；其余各組加入21 mmol/L的葡萄糖、0.37 mmol/L的棕櫚酸100 μL制作IR的Min6細胞模型(細胞增殖能力、胰島素分泌能力顯著降低為成模標準)[10～12]。

1.3 各組給藥方法 二甲雙胍組給予100 μg/L的二甲雙胍。雙益方組分別給予50、100、200 μg/L的雙益方。山茱萸組、黃芪組、黃連組、葛根組、桑白皮組、佩蘭組、葛根素組、1-脫氧野尻霉素組、小檗堿組、黃芪甲苷組、馬錢苷組、熊果酸組、毛蕊異黃酮葡萄糖苷組分別給予50、100、200 μg/L的相應藥物。

1.4 胰島素分泌情況觀察 采用胰島素分泌實驗。各組于給藥24 h后以低糖(2.8 mmol/L)作用2 h，抽取細胞上清液，檢測胰島素分泌情況；抽取上清液后的各孔細胞再給予高糖(16.7 mmol/L)作用2 h，收集細胞上清液，檢測胰島素分泌情況。

1.5 細胞增殖能力檢測 各組分別于給藥24、48 h時每孔加入10 μL的細胞增殖能力檢測試液，按試劑盒說明書進行操作。以OD值代表細胞的增殖能力[13，14]。

1.6 凋亡細胞檢測 于給藥24 h后采用雙染法檢測正常組、IR模型組、二甲雙胍組、雙益方組的凋亡細胞，計算細胞凋亡率。

1.7 細胞中ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2蛋白檢測 于給藥24 h后采用Western blotting法檢測正常組、IR模型組、二甲雙胍組、雙益方組細胞中的ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2蛋白。蛋白相對表達量用灰度值表示[15,16]。

2 結果

2.1 各組細胞胰島素分泌水平比較 IR模型組細胞高糖、低糖刺激下胰島素分泌水平均低于正常組(P均<0.05)。二甲雙胍組、黃芪組、葛根組、雙益方組、黃芪甲苷組、山茱萸組、1-脫氧野尻霉素組、葛根素組、小檗堿組胰島素分泌水平高于IR模型組(P均<0.05)。詳見表1。

2.2 各組細胞增殖能力比較 IR模型組細胞增殖能力低于正常組(P均<0.05)；二甲雙胍組、雙益方組、黃芪組、黃芪甲苷組、1-脫氧野尻霉素組、山茱萸組細胞增殖能力高于IR模型組，且隨著藥物作用濃度升高，細胞增殖能力增強(P均<0.05)。詳見表1。

2.3 細胞凋亡情況比較 正常組、IR模型組、二甲雙胍組、雙益方50 μg/L組、雙益方100 μg/L組、雙益方200 μg/L組細胞凋亡率分別為30.10%、42.60%、28.10%、32.35%、26.30%、14.45%，IR模型組細胞凋亡率高于正常組，雙益方50 μg/L組、雙益方100 μg/L組、雙益方200 μg/L組細胞凋亡率低于IR模型組(P均<0.05)。

2.4 各組細胞中MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達比較 IR模型組細胞中MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相對表達量低于正常組(P均<0.05)；二甲雙胍組及雙益方組細胞中MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相對表達量高于IR模型組(P均<0.05)。詳見表2。

3 討論

胰島β細胞功能失調和細胞凋亡是導致胰島素分泌減少的主要原因，也在2型糖尿病IR發生過程中發揮重要作用。對胰島β細胞進行保護、改善胰島素分泌水平是2型糖尿病治療的關鍵。Min6細胞在高糖濃度作用時胰島素分泌量明顯增加，常作為研究藥物對胰島功能影響的經典細胞。本實驗采用Min6細胞制作IR模型，觀察雙益方、組方中藥及其有效成分對Min6細胞胰島素分泌、細胞增殖和凋亡的影響，分析復方的有效成分及作用機制。

表1 各組細胞胰島素分泌水平及OD值比較

注：與正常組相比，*P<0.05；與IR模型組相比，#P<0.05；與二甲雙胍組相比，※P<0.05。

表2 各組細胞中MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白 相對表達量比較

注：與正常組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

高糖導致β細胞分泌胰島素功能障礙和胰島β細胞數量減少。高糖刺激能夠導致胰島素分泌負荷增大，分泌能力下降，低糖條件下胰島素分泌能力會升高。本研究胰島素分泌實驗結果顯示，IR模型組細胞高糖、低糖刺激下胰島素分泌水平均低于正常組；二甲雙胍組、黃芪組、葛根組、雙益方組、黃芪甲苷組、山茱萸組、1-脫氧野尻霉素組、葛根素組、小檗堿組胰島素分泌水平高于IR模型組。上述結果提示二甲雙胍、雙益方、小檗堿、山茱萸、葛根、黃芪甲苷、黃芪、1-脫氧野尻霉素、葛根素可在一定程度上促進高糖刺激及低糖刺激條件下的胰島素分泌，以雙益方、黃芪、黃芪甲苷、1-脫氧野尻霉素促進胰島素分泌的效果較好。本研究結果還顯示，IR模型組細胞增殖能力低于正常組，細胞凋亡率高于正常組；二甲雙胍組、雙益方組、黃芪組、黃芪甲苷組、1-脫氧野尻霉素組、山茱萸組細胞增殖能力高于IR模型組，雙益方各組細胞凋亡率低于IR模型組。上述結果證實了胰島β細胞凋亡與IR的發生有關，而雙益方可能通過促進細胞增殖、抑制細胞凋亡干預IR的進展。

絲裂原活化蛋白激酶的信號轉導通路在胰島β細胞增殖等過程中可發揮重要作用。Ras-Raf-MEK-ERK通路為經典的絲裂原活化蛋白激酶的信號轉導通路。我們觀察了各組細胞中MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表達變化，發現IR模型組細胞中MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相對表達量低于正常組，二甲雙胍組及雙益方組細胞中MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相對表達量高于IR模型組，提示雙益方抑制Min6細胞凋亡可能是通過調節Ras-Raf-MEK-ERK通路功能實現的。

結合上述研究結果，我們認為，雙益方及其黃芪、葛根、黃芪甲苷、山茱萸、1-脫氧野尻霉素、葛根素、小檗堿等成分可有效提高IR Min6細胞的胰島素分泌水平，促進Min6細胞增殖并抑制其凋亡，作用機制可能與ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2蛋白表達上調有關。雙益方調節胰島素分泌是其組方中藥及有效成分共同作用的結果。

[1] Xu Y, Wang L, He J, et al. Prevalence and control of diabetes in Chinese adults[J]. JAMA, 2013,310(9):948-959．

[2] 張毓輝,萬泉,柴培培,等.我國糖尿病醫療費用及籌資負擔研究[J].中國衛生經濟,2017,36(4):17-19.

[3] 陳小麗,梁少蓮,蔡時雨,等.臨床合理用藥指導對2型糖尿病患者用藥依從性的影響[J].中國藥業,2017,26(10):91-93.

[4] 劉國棟,王樺,汪琦,等.四大類主要慢性病流行現狀與應對策略[J].中國社會醫學雜志,2017,34(1):53-56.

[5] 王海焱,劉銅華.中藥復方治療2 型糖尿病胰島素抵抗的研究[J].西部中醫藥,2017,30(5):137-140.

[6] 崔鵬,田春雨,張艷萍,等.雙益方對2型糖尿病大鼠SOD、MDA、FFA影響的實驗研究[J].時珍國醫國藥,2013,24(8):1840-1842.

[7] 田春雨,劉志霞,王亞,等.雙益降糖方對2型糖尿病大鼠糖、脂代謝的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(9):177-180.

[8] 田春雨,薄海美,喇孝瑾,等.正交設計法優選雙益降糖方中小檗堿的提取工藝[J].河北聯合大學學報(醫學版),2013,15(1):51-52.

[9] 田春雨,薄海美,喇孝瑾,等.正交設計法優選雙益降糖方中葛根素的提取工藝[J].河北聯合大學學報(醫學版),2013,15(2):158-159.

[10] 程瑞婷,董玉山,李繼安,等.十子代平方影響小鼠MIN6細胞凋亡及MEK1/2、ERK1/2的表達[J].中國組織工程研究,2017,21(4):603-608.

[11] 栗明,方芳,西旺,等.烏芪通絡膠囊對糖尿病實驗性大鼠ERK1/2蛋白及8-OHdG含量的影響[J]. 中醫藥學報,2014,42(6):52-54.

[12] 程瑞婷,王晨斌,田春雨,等.MIN6細胞損傷模型不同造模方法對比研究[J].華北理工大學學報(醫學版),2017,19(4):644-646.

[13] 李思源,吳媛媛,李軍,等.胰升血糖素對Min6細胞增殖活力及胰島素分泌影響的研究[J].中國糖尿病雜志,2015,23(7):644-646.

[14] 高丕堯,龍軍先,甘嘉亮,等.CCK-8法與Alamar blue法對RKO細胞株增殖活力測試條件的對比分析[J].華西藥學雜志,2015,30(1):38-41.

[15] 劉虹,馬艷,邵榮光.磷酸化蛋白EBP50通過降低ERK1/2活性抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖能力[J].中國藥理學通報,2015,31(1):55-59.

[16] 郭麗萍.活性維生素D3對糖尿病大鼠胰島β細胞功能影響的研究[J].中國醫藥導報,2013,10(12):27-29.

EffectsofShuangyidecoctionanditsactiveingredientsoninsulinsecretionproliferationandapoptosisofIRmousepancreaticβcellstrain

TIANChunyu,MALeilei,LAXiaojin

(NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063210,China)

ObjectiveTo observe the effects of Shuangyi decoction (SY) and its effective ingredients on the insulin secretion, cell proliferation, and apoptosis of islet β cells Min 6 in insulin resistant (IR) mice, and to analyze the action mechanism.MethodsWe cultured Min6 cells and then divided them into the normal group, IR model group, metformin group, SY group, single herb of SY group [Cornus officinalis (Shanzhuyu), Astragalus membranaceus (Huangqi), Coptis chinensis (Huanglian), Puerarin (Gegen), Cortex mori radicis (Sangbaipi), and Eupatorium (Peilan)], and SY effective ingredient group (1-deoxynojirimycin, berberine, astragaloside, ursolic acid, loganin, calycosin glucoside, and puerarin). The normal group was cultured with phenol red free medium; the other groups were added with glucose and palmitic acid in order to make the Min6 cell IR models. Metformin group was added with 100 g/L metformin. SY group, Shanzhuyu group, Huangqi group, Huanglian group, Gegen group, Sangbaipi group, Peilan group, 1-deoxynojirimycin, berberine, astragaloside, ursolic acid, loganin, calycosin glucoside, puerarin groups were added with 50, 100, and 200 g/L the corresponding drugs. Insulin secretion test was performed at 24 h after administration, and the level of insulin secretion was detected. The proliferation ability of cells at 24 h and 48 h after administration was detected by CCK-8 kit. Apoptotic cells were detected at 24 h after administration by double staining in the normal group, IR model group, metformin group, and SY group; the apoptotic rate was also calculated; the protein exoression of ERK1/2, p-ERK1/2, MEK1/2 was detected by Western blotting.ResultsUnder the condition of high glucose and low sugar, the insulin secretion of the IR model group was lower than that of normal group (P<0.05). The insulin secretion levels of the metformin group, Huangqi group and Gegen group, SY group, astragaloside group, Shanzhuyu group, 1-deoxynojirimycin group, puerarin group, and berberine group were higher than that of the IR model group (allP<0.05). The cell proliferation ability of IR model group was lower than that of the normal group (P<0.05); the cell proliferation abilities of the metformin group, SY group, Huangqi group, astragaloside group, 1- deoxynojirimycin group, and Shanzhuyu group were higher than that of IR model group (P<0.05). The apoptosis rate of the IR model group was higher than that of the normal group, and the apoptosis rate of the SY group was lower than that of the IR model group (P<0.05). The expression levels of MEK1/2, ERK1/2, and p-ERK1/2 proteins were lower in the IR model group than in the normal group (P<0.05); the expression levels of MEK1/2, ERK1/2, and p-ERK1/2 proteins were higher in the metformin group and SY group than in the IR model group (allP<0.05).ConclusionsSY, and its effective ingredients Huangqi, Gegen, astragaloside, Shanzhuyu,1-deoxynojirimycin, puerarin, and berberine can effectively improve the IR Min6 cell insulin secretion, promote Min6 cell proliferation and inhibit the apoptosis by up-regulating the expression of ERK1/2, p-ERK1/2 and MEK 1/2 protein.

Shuangyi decoction; type 2 diabetes mellitus; insulin resistance; insulin secretion test; cell proliferation; apoptosis; mouse pancreatic β cell strain

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.39.006

R587.1

A

1002-266X(2017)39-0023-04

河北省自然科學基金資助項目(H2015209025)；河北省高等學校科學技術研究項目(QN2015119)。

田春雨(1981-)，男，博士，副教授，主要研究方向為糖尿病的中藥防治。E-mail： tcy4479@sina.com

2017-06-20)