宮頸上皮內瘤變及宮頸鱗癌組織中p16、CUL4B表達觀察

陳珊珊，吳淑霞，王永利，王鑫，任興業

(1濰坊醫學院，山東濰坊261053；2濟南市第五人民醫院)

宮頸上皮內瘤變及宮頸鱗癌組織中p16、CUL4B表達觀察

陳珊珊1，吳淑霞2，王永利2，王鑫2，任興業2

(1濰坊醫學院，山東濰坊261053；2濟南市第五人民醫院)

目的觀察宮頸上皮內瘤變(CIN)及宮頸鱗癌組織中p16、Cullin4B(CUL4B)的表達變化。方法選取正常宮頸組織、CIN1、CIN2、CIN3、宮頸鱗癌組織標本共計173例份，分為正常宮頸組30例、CIN1組33例、CIN2組38例、CIN3組40例、宮頸鱗癌組32例。采用免疫組化法檢測各組中的p16、CUL4B。結果正常宮頸組、CIN1組、CIN2組、CIN3組、宮頸鱗癌組p16蛋白表達陽性分別為1(3.33%)、13(39.39%)、30(78.95%)、40(100%)、32(100%)例；CUL4B表達陽性分別為0、11(33.33%)、29(76.32%)、40(100%)、32(100%)例。CIN各組和宮頸鱗癌組p16、CUL4B蛋白陽性表達率高于正常宮頸組，其中p16、CUL4B在CIN1、2、3組中的陽性表達率依次增高，在宮頸鱗癌組中的陽性表達率高于CIN1組和CIN2組(P均<0.05)。p16、CUL4B在宮頸病變組織中的表達呈正相關(r=0.969，P<0.01)。結論CIN及宮頸鱗癌組織中p16、CUL4B表達高于正常宮頸組織，且隨著宮頸病變程度加重而增高。p16、CUL4B表達可能與宮頸病變的發生和進展有關，二者之間可能存在相互作用。

宮頸上皮內瘤變；宮頸腫瘤；宮頸癌；p16；Cullin4B

宮頸癌病死率居女性生殖系統惡性腫瘤的第二位，且發病有年輕化趨勢[1]。高危型人類乳頭狀瘤病毒(HPV)持續感染是宮頸癌發生的主要因素[2]。CIN是宮頸癌的癌前病變，但并非所有的CIN都會進展為宮頸癌[3,4]。目前宮頸疾病的“三階梯”診療方法即宮頸細胞學檢查、陰道鏡檢查、組織病理學檢查明顯提高了早期宮頸癌的檢出率，但存在過度治療的問題。p16檢查能夠提高診斷CIN及早期宮頸浸潤癌的敏感性，但特異性并非100%[5]，因此需要聯合其他生物標志物來提高特異性。新近研究發現，Cullin4B(CUL4B)作為Cullin家族成員之一，通過調控p16等抑癌基因的表達促進腫瘤細胞增殖、侵襲和生長。研究[6]發現，在宮頸癌組織中，CUL4B可抑制抑癌基因p16和PTEN表達，促進腫瘤細胞增殖、遷移和裸鼠成瘤。本研究觀察了CIN及宮頸鱗癌組織中p16、CUL4B的表達變化，并分析其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 組織標本與主要材料 收集濟南市第五人民醫院2010年7月～2016年1月活檢組織病理診斷為正常宮頸組織、CIN1、CIN2、CIN3、宮頸鱗癌組織標本共計173例份，分為正常宮頸組30例、CIN1組33例、CIN2組38例、CIN3組40例、宮頸鱗癌組32例。標本來源患者平均年齡為44.4歲，中位年齡為44歲。Anti-CUL4B抗體由Sigma-Aldrich公司提供；Anti-CDKN2A/p16INK4a抗體由Abcam公司提供；超敏二步法免疫組化檢測試劑由北京中杉金橋生物技術公司提供。

1.2 p16、CUL4B檢測方法 將各組石蠟標本進行連續切片(厚度4 μm)，常規烘烤、脫蠟、水化，枸櫞酸緩沖液高壓修復，3%H2O2抑制內源性過氧化物酶，PBS沖洗3次，每次3 min，分別滴加p16、CUL4B抗體，4 ℃冰箱過夜，PBS沖洗3次，每次3 min，滴加二抗，室溫反應30 min，PBS沖洗，DAB顯色后蘇木紫復染，流水沖洗，梯度酒精脫水，中性樹脂封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。以細胞核和(或)細胞質出現棕色或棕黃色顆粒為p16陽性細胞，以細胞核內出現棕色或棕黃色顆粒為CUL4B陽性細胞。采用半定量積分法判定結果：染色強度為黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；陽性細胞百分比≤5%計0分，>5%～25%計1分，>25%～50%計2分，>50%～75%計3分，>75%計4分；上述兩項得分相乘，0為陰性(-)，1～4為弱陽性(+)，5～8為中度陽性(++)，9～12為強陽性(+++)，以+～+++判定為蛋白表達陽性。

2 結果

2.1 不同宮頸病變組織中p16、CUL4B表達比較 p16定位于細胞核或胞核伴胞質，在CIN1組織中以弱陽性表達為主，在CIN2組織、CIN3組織或宮頸鱗癌組織中以強陽性表達為主，染色程度隨著組織病變程度的增加而增加。CUL4B定位于細胞核，CUL4B在宮頸正常組織中幾乎不表達，在CIN1組織中以弱陽性表達為主，在CIN2組織、CIN3組織或宮頸鱗癌組織中以強陽性表達為主，染色程度隨著組織病變程度的增加而增加。正常宮頸組、CIN1組、CIN2組、CIN3組、宮頸鱗癌組p16蛋白表達陽性分別為1(3.33%)、13(39.39%)、30(78.95%)、40(100%)、32(100%)例；CUL4B表達陽性分別為0、11(33.33%)、29(76.32%)、40(100%)、32(100%)例。CIN各組和宮頸鱗癌組p16、CUL4B蛋白陽性表達率高于正常宮頸組，其中p16、CUL4B在CIN1、2、3組中的陽性表達率依次增高，在宮頸鱗癌組中的陽性表達率高于CIN1組和CIN2組(P均<0.05)。見圖1、2。

注：A為CIN1組；B為CIN2組；C為CIN3組；D為宮頸鱗癌組。

圖1不同宮頸病變組織中p16表達情況

注：A為CIN1組；B為CIN2組；C為CIN3組；D為宮頸鱗癌組。

圖2不同宮頸病變組織中CUL4B表達情況

2.2 CUL4B、p16在宮頸病變組織中表達的相關性 CUL4B、p16在宮頸病變組織中的表達呈正相關(r=0.969，P<0.01)。

3 討論

宮頸癌的發生、發展是一個逐漸演變的長期過程，其主要致病因素是高危型HPV病毒的持續感染[2]。99.7%的宮頸浸潤癌患者可以檢測到HPV DNA[7]。有研究顯示，只要做到早發現、早診斷、早治療，宮頸癌是可以預防并治愈的[4]。及時診斷CIN3和早期宮頸癌是有效防治宮頸癌的根本[8]。傳統的宮頸癌篩查方法受病理醫生主觀因素的影響，會存在一定的假陽性率[9]。生物標志物檢測有助于評估CIN進展的危險性，提高宮頸癌早期確診率和特異性，避免過度治療。本研究通過觀察p16、CUL4B在正常宮頸組織、CIN組織、宮頸鱗癌組織中的表達變化，探討二者在宮頸疾病發病及診斷中的意義。

p16是細胞周期素依賴激酶(CDK)的抑制因子，p16基因的缺失與突變影響腫瘤的發生與發展[10]。Tsoumpou等[11]通過免疫組化法檢測發現p16的表達水平與宮頸病變嚴重程度呈正相關。馬袁英等[12]研究也發現，p16的表達隨著CIN病變級別的增高而增高，提示p16可作為一個有價值的標志物診斷CIN3和宮頸鱗癌。本研究結果顯示，p16在各級別宮頸上皮內瘤變、宮頸鱗癌組織中的表達均明顯高于正常宮頸組織，且各CIN組間差異有統計學意義，與文獻報道相符。然而，Merserve等[13]發現，宮頸病變組織免疫組化染色中，p16存在過度著色的問題，僅僅根據p16來診斷宮頸病變有過度診斷的風險，需結合其他生物標志物聯合檢測[5]。

CUL4B作為骨架蛋白與RING家族蛋白相結合形成Cullin4B-RING E3泛素連接酶復合物[14]。泛素蛋白酶體途徑是細胞內ATP依賴的蛋白質選擇性降解途徑，是生物體內重要的蛋白質質控系統，參與細胞凋亡、細胞周期、信號轉導等多種生物過程，對維持細胞的穩態起著至關重要的作用[15]。CUL4B特有的N端，使其主要定位于細胞核，參與調控核內的結構與功能[16]。研究發現，CUL4B通過與組蛋白甲基轉移酶SUV39H1、異染色質蛋白HP1及DNA甲基轉移酶DNMT3A之間的相互作用，參與DNA甲基化所介導的轉錄抑制過程。在宮頸癌組織中，CUL4B可使抑癌基因IGFBP3的啟動子發生甲基化并抑制IGFBP3的轉錄，同時CRL4B還能協同PRC2復合物共同調控多種信號通路的基因表達，抑制抑癌基因p16和PTEN表達，促進腫瘤細胞增殖、遷移和裸鼠成瘤[6]。新近研究發現CUL4B在非小細胞肺癌、胃癌、結腸癌、子宮內膜癌、宮頸癌等多種腫瘤組織中也表達上調，提示CUL4B可能是一種新的原癌基因[17～20]。本研究結果顯示，CIN各組和宮頸鱗癌組CUL4B蛋白陽性表達率高于正常宮頸組，其中CUL4B在CIN1、2、3組中的陽性表達率依次增高，在宮頸鱗癌組中的陽性表達率高于CIN1組和CIN2組，提示CUL4B的表達增高與宮頸癌的發生及早期演變有關。進一步進行Spearman等級相關分析顯示，CUL4B、p16在宮頸病變組織中的表達呈正相關，提示CUL4B可能通過對抑癌基因p16的調控促進宮頸癌的發生、發展。

總之，CIN及宮頸鱗癌組織中p16、CUL4B表達高于正常宮頸組織，且隨著宮頸病變程度加重而增高。p16、CUL4B表達可能與宮頸病變的發生和進展有關，二者之間可能存在相互作用。CUL4B、p16聯合檢測可能對診斷CIN3及早期宮頸癌具有重要意義。

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