45份菜用大黃的SRAP標記引物篩選及親緣關系分析

邵珠田+姜立娜+郭小菲+蔡祖國+趙一鵬

摘要：以45份引種的菜用大黃遺傳背景未知為出發點，利用已報道的相關序列擴增多態性（sequence-related amplified polymorphism，簡稱SRAP）引物，對這些引種材料進行遺傳多樣性分析，旨在闡明這些材料的親緣關系。結果表明：在選用的182對引物組合中有42對引物擴增產物穩定、條帶清晰、多態性較好，可以用作菜用大黃遺傳多樣性分析；利用42對引物對45份材料擴增后共獲得230個等位基因位點，其中多態性位點202個，平均多態性位點比例達到878%。基于非加權組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，簡稱UPGMA）的聚類分析結果表明：45份菜用大黃材料聚為7類，雖然來源地相同的大部分種群可以聚在同一個類群內，但種群間存在遺傳交叉現象，揭示了種群間的親緣關系，為這些引入材料的進一步利用提供了參考。

關鍵詞：菜用大黃；SRAP分子標記；引物篩選；親緣關系

中圖分類號： S644.903文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）17-0039-03

通信作者：趙一鵬，博士，教授，主要從事園藝植物種質資源與育種研究。E-mail：yzhao36@163.com。菜用大黃（Rheum rhaponticum L.）別稱食用大黃、圓葉大黃、酸菜等，為蓼科（Polygonaceae）大黃屬（Rheum）中以葉柄為蔬菜的栽培種，英文統稱為Rhubarb。菜用大黃屬于多年生草本植物，其葉柄具有粗大多汁、營養豐富、氣味清新芬芳、風味獨特、口感微酸等特點，是理想的芳香保健類蔬菜。在國外，菜用大黃被廣泛用于制作餡餅、果醬、果凍、面包、蛋糕、沙拉、大黃果酒等各類甜品及加工成高級果蔬汁飲料[1-4]。

目前，國內對大黃屬植物的研究和開發利用僅限于藥用大黃相關資源，對菜用大黃的系統研究較少。2004年以來，河南科技學院菜用大黃引種及種質資源利用課題組趙一鵬博士在與國外合作的基礎上，首次開展了菜用大黃優良種質資源的引種、組織培養技術[3-6]、栽培學特性及營養成分分析[7]、根尖染色體觀察及核型分析[8]等研究，但關于菜用大黃起源、資源親緣關系的研究尚未開展。本研究在進行了相關序列擴增多態性（sequence-related amplified polymorphism，簡稱SRAP）體系優化的基礎上[9]，利用多態性高的42對引物組合對從國內外收集到的45份菜用大黃材料進行親緣關系分析，旨在了解這些菜用大黃材料的遺傳背景，為今后菜用大黃優良品種選育和分子生物學研究提供一定的技術支持。

1材料與方法

1.1 材料

用于引物篩選的菜用大黃材料為樣本4號，種子來源于美國。用于親緣關系分析的45份材料，采自河南科技學院菜用大黃資源圃，其中從美國引種材料13份，分別編號為1～13；從英國引種材料20份，分別編號為14～28、41～45；從北京引種材料12份，分別編號為29～40。于2016年4月上旬采集新鮮、無病蟲害的葉片，用清水沖洗干凈，置于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2方法

1.2.1模板DNA的提取及質量檢測基因組DNA提取參照Liu等改良十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[10]，用Eppendorf核酸蛋白測定儀（德國）檢測所提DNA的純度及濃度，并用無菌ddH2O稀釋至10 ng/μL，-20 ℃保存備用。

1.2.2SRAP-PCR引物的篩選SRAP-PCR擴增程序參照陳萬勝等的方法[11]，即94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，35 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，5個循環；94 ℃ 45 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物于4 ℃保存備用。菜用大黃SRAP-PCR反應體系為筆者所在課題組郭小菲等已優化的體系[9]，即25μL體系中包含2.50 μL 10×PCR Buffer、30 ng模板DNA、2.50 mmol/L Mg2+、0.25 mmol/L dNTPs、0.04 U/μL Taq DNA聚合酶，各0.50 μmol/L上下游引物，剩余體積用雙蒸水補足。以上試劑均購自TaKaRa公司。引物序列參考Li等的報道[12-15]，共選用14條正向引物、13條反向引物（表1），可組合成182對引物。利用4號材料對上述引物進行篩選。依據電泳結果，選擇擴增產物多態性豐富、條帶清晰、重復性好的引物組合進行菜用大黃的親緣關系研究。

1.2.3PCR擴增產物的檢測擴增反應結束后，在產物中加入5 μL 6×Loading Buffer，混勻，取2.5 μL混合液上樣于6%非變性聚丙烯酰胺凝膠中。預電泳電壓90 V，時間 30 min；電泳電壓120 V，時間3 h。電泳結束后的膠板采用袁菊紅等的銀染法[16]進行染色。

1.2.4數據統計與分析根據電泳結果，在凝膠相同遷移位置上，擴增有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，最終組成1個由45份材料和所有擴增位點等位基因組成的“1，0”矩陣。利用NTsys-pc Version 2.10e 軟件，采用非加權組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，簡稱UPGMA）

2結果與分析

2.1SRAP-PCR引物的篩選及擴增產物的多態性分析

從182對引物中共篩選出擴增產物重復性好、多態性高和條帶清晰的引物組合42對，圖1為部分引物篩選擴增結果。應用篩選的42對多態性引物組合對45份材料模板DNA樣品進行PCR擴增，結果共獲得230個等位基因位點，其中202個為多態性位點。每個引物組合的多態性比率在16.7%～1000%之間，平均多態性比例達到87.8%；平均每對引物擴增條帶數5.5個，平均多態性條帶數4.8個；在42對引物中，引物組合E1-M4擴增條帶數最多，共11個，E12-M4組合擴增條帶數最少，只有1個（表2）。引物組合E1-M4的擴增結果如圖2所示。

2.2菜用大黃遺傳相似性與聚類分析

45份樣品經NTSYS軟件聚類分析結果顯示，在遺傳相似系數0.68處可將45份樣品聚為7類，第1類是34號、35號，種子來源于北京；第2類是25號、26號、27號、28號，種子來源于英國；第3類為36號、37號，種子同樣來源于北京；第4類有13號、15號、38號、39號、40號、42號6個樣品；第5類為2號、3號、4號、8號、10號、11號、12號和24號共8個樣品，除24號來源于英國外，其余均引種于美國；1號單獨聚為1類，引種地為美國，其余22個樣品聚為一大類；45份樣品間的遺傳相似系數在0.514 9～0.811 9之間，遺傳距離在0.117 1～0.703 0之間（圖3）。

3討論

形態標記是植物分類學上最古老、最簡便易行的方法，但是由于數量性狀的遺傳機制復雜、遺傳力低、容易受到環境因素的影響、工作量大等因素，該方法不能完全滿足親緣關系研究的需要。SRAP標記是一種基于PCR的DNA分子標記技術，具有操作簡單、引物通用性與多態性高、重復性好、標記位點在基因組中分布均勻等優點[18]。近年來利用SRAP標記技術進行品種鑒定，分析種質間的遺傳多樣性、品種間的親緣關系等已經有了較多報道[19-21]。但在關于大黃屬植物的研究中， 僅見陳大霞等利用SRAP標記對正品大黃的遺傳關系進行了分析，其研究結果表明，3種正品大黃間的SRAP的多態性比例為73.2%[22]。而本研究中菜用大黃多態性比例為87.8%，多態性相對較高，筆者認為與本研究的供試材料來源地有關，因為45份菜用大黃材料來源于北京、美國、英國等不同地區，遺傳基礎相差較遠，導致變異位點較多。從本試驗結果來看，SRAP分子標記可以成為一種評價種質資源親緣關系的新技術。

運用SRAP分子標記技術對45份菜用大黃材料進行親緣關系研究，從遺傳相似系數和聚類樹狀圖來看，個體間存在較大的差異。在遺傳相似系數0.68處可將供試的45份菜用大黃樣品聚為7類，第1類是34號、35號，種子來源于北京，結果期種子均呈現黃綠色，葉柄表面有短毛、粗糙且斑點密布；第2類是25號、26號、27號、28號，種子來源于英國，葉柄基部均呈現深粉色，表面較為光滑；第3類為36號、37號，引種于北京，結果期種子翅緣均呈現粉紅色。雖然來源地相同的大部分樣品可以聚在同一個類群內，但仍出現了交叉聚類現象。24號種子來源于英國，卻與來源于美國的2號、3號、4號、8號、10號、11號、12號種子聚在了第5類；13號、15號種子又與來源于北京的38號、39號、40號種子聚在了第4類。出現這種情況的原因可能是由于長期的選擇進化及不斷的相互引種，導致各生態地理群之間種質的相互滲透。本研究通過SRAP標記技術對收集到的45份國內外菜用大黃材料進行了初步的親緣關系分析，為今后進行菜用大黃遺傳育種和品種鑒定提供了一定的技術支持。

參考文獻：

[1]盧莉，趙一鵬. 菜用大黃的研究進展[J]. 廣東農業科學，2008（2）：19-21，27.

[2]Zhao Y P. Somaclonal variation and crop failure of micro-propagated rhubarb[D]. Colchester，UK：University of Essex，2004.

[3]盧莉，趙一鵬，蔡祖國，等. 歐洲大黃種子發芽特性研究[J]. 種子，2007，26（3）：35-37.

[4]趙一鵬，Grout B W，周巖. 歐洲大黃莖尖組織培養與快速繁殖[J]. 河南職業技術師范學院學報，2004，32（3）：24-25，28.

[5]盧莉. 菜用大黃的種子萌發特性與離體快繁技術研究[D]. 新鄉：河南師范大學，2008.

[6]張有鐸，蔡祖國，趙一鵬. 菜用大黃組培苗生根特性研究[J]. 湖北農業科學，2009，48（11）：2759-2761.

[7]吳亞蓓. 菜用大黃栽培學特性與營養成分分析[D]. 新鄉：河南科技學院，2012.

[8]任文娟，郭小菲，姜立娜，等. 菜用大黃染色體制片優化及核型分析[J]. 華北農學報，2013，28（5）：128-132.

[9]郭小菲，姜立娜，蔡祖國，等. 菜用大黃 SRAP-PCR 反應體系的

優化及驗證[J]. 華北農學報，2014，29（4）：105-110.

[10]Liu L，Guo W，Zhu X，et al. Inheritance and fine mapping of fertility restoration for cytoplasmic male sterility in Gossypium hirsutum L.[J]. Theoretical and Applied Genetics，2003，106（3）：461-469.

[11]陳萬勝，王元英，羅成剛，等. 利用正交設計優化煙草SRAP反應體系[J]. 分子植物育種，2008，6（1）：177-182.

[12]Li G，Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism （SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theoretical and Applied Genetics，2001，103（2/3）：455-461.

[13]Ferriol M，Picó B，Nuez F. Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers[J]. Theoretical and Applied Genetics，2003，107（2）：271-282.

[14]林忠旭，張獻龍，聶以春. 新型標記SRAP在棉花F2分離群體及遺傳多樣性評價中的適用性分析[J]. 遺傳學報，2004，31（6）：622-626.

[15]王和勇，喬愛民，陳敏. 植物遺傳標記的發展及應用[J]. 仲愷農業技術學院學報，2000，13（4）：58-64.

[16]袁菊紅，權俊萍，胡綿好，等. 石蒜SRAP-PCR擴增體系的建立與優化[J]. 植物資源與環境學報，2007，16（4）：1-6.

[17]尹躍. 枸杞品種（系）分子鑒定及親緣關系分析[D]. 福州：福建農林大學，2013.

[18]劉雅輝，王秀萍，魯雪林，等. 棉花耐鹽相關序列擴增多態性（SRAP）分子標記篩選[J]. 江蘇農業學報，2015，31（3）：484-488.

[19]沈國正，李春楠，傅巧娟，等. 一串紅SRAP標記的建立與品種鑒定[J]. 浙江農業學報，2011，23（1）：84-89.

[20]顏璐茜，李佳蔓，員濤，等. 滇楊遺傳多樣性的SRAP分析[J]. 生物技術通報，2016，32（4）：159-167.

[21]肖政，蘇家樂，劉曉青，等. 杜鵑花種質資源遺傳多樣性的SRAP分析[J]. 江蘇農業學報，2016，32（2）：442-447.

[22]陳大霞，李隆云，鐘國躍，等. 用SRAP標記分析正品大黃的遺傳關系[J]. 中國中藥雜志，2008，33（20）：2309-2312.陳興銀，石建明，楊鵬，等. 無籽刺梨及其近緣種ITS序列分析[J]. 江蘇農業科學，2017，45（17）：42-46.