HCV NS4B表達載體的構建及其對細胞凋亡的影響*

宋彬妤 ，趙嘉偉 ，宋靜 ，陳思思 ，胡志廷 ，韓昕 ，王敏敏 ，任來峰

（1.山西醫科大學汾陽學院 科技中心，山西 汾陽 032200；2.廈門大學醫學院 臨床醫學系，福建 廈門 361002；3.山西醫科大學汾陽學院 醫學檢驗系，山西 汾陽 032200）

HCV NS4B表達載體的構建及其對細胞凋亡的影響*

宋彬妤1，趙嘉偉2，宋靜3，陳思思3，胡志廷3，韓昕3，王敏敏1，任來峰3

（1.山西醫科大學汾陽學院 科技中心，山西 汾陽 032200；2.廈門大學醫學院 臨床醫學系，福建 廈門 361002；3.山西醫科大學汾陽學院 醫學檢驗系，山西 汾陽 032200）

目的 構建丙型肝炎病毒（HCV）2a型非結構蛋白4B（NS4B）的真核表達載體，并觀察其對骨肉瘤細胞U2OS凋亡的影響。方法 以質粒PJFH1為模板，通過PCR反應擴增NS4B目的基因片段，采用同源重組法與PCMV-tag2b載體相連，轉化大腸桿菌感受態DH5α，篩選正確的克隆。以脂質體為介導轉染U2OS細胞，通過Western blot檢測NS4B蛋白的表達，免疫熒光檢測細胞的凋亡。結果 構建pCMV-tag2b-NS4B重組質粒，經測序其與NCBI公布的序列完全一致，并可在U2OS細胞中表達，DAPI檢測顯示細胞凋亡率為（17.25±2.95）%，對照組凋亡率為（6.53±2.36）%。結論 成功構建NS4B的真核表達載體，并可在U2OS細胞中表達，誘導細胞凋亡。

丙型肝炎病毒；非結構蛋白4B；重組質粒；凋亡

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染是造成慢性肝炎、肝纖維化及肝細胞肝癌的重要病因之一，嚴重威脅人類的生命健康[1]。研究表明，HCV非結構蛋白 4B（nonstructural protein 4B，NS4B）參與病毒復制、組裝及釋放等過程[2-3]。最近研究表明，NS4B可能參與宿主細胞的多種信號轉導通路，干擾轉錄調控、內質網應激、惡性轉化等過程，但各研究結果存在分歧[4-6]。因此，本研究構建HCV NS4B表達載體，并觀察其對人骨肉瘤細胞U2OS凋亡的影響，為后續進一步研究其致病機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

U2OS細胞株保存在液氮中，質粒pCMV-Tag 2b和pJFH1（HCV 2a型cDNA）置入-20℃冰箱冷凍保存，大腸埃希菌DH5α購自北京康為世紀生物科技有限公司，In-Fusion HD Cloning Kit購自美國Clontech公司，限制性內切酶HindⅢ購自美國NEB公司，質粒抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒均購自美國Promega公司。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，DMEM（高糖）培養基、ECL化學發光試劑購自武漢博士德生物工程有限公司，DNA轉染試劑Lipofectamine 2000及核染料DAPI購自美國Invitrogen公司，抗Flag抗體和二抗（HRP標記）購自美國Sigma公司，引物合成和DNA測序由上海生工生物工程股份有限公司完成，DM 4000型熒光顯微鏡購自德國Leica公司，Eon型酶標儀購自美國BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1 NS4B引物的設計與合成 根據質粒pJFH1序列和質粒pCMV-Tag 2bHindⅢ酶切位點兩端的序列，利用同源重組的原理設計NS4B引物，正向引物 P1：5'-ATTCGATATCAAGCTTGCCTCTAGGGCGG CTCTC-3'，正向引物 P2：5'-CGGTATCGATAAGCTT TCAGCATGGGATGGGGCAGT-3'。

1.2.2 NS4B擴增及鑒定 以質粒pJFH1為模板，以P1、P2為引物，通過PCR反應擴增目的基因NS4B，反應條件：95℃預變性 2 min，95℃變性 25 s，55℃退火30 s，72℃延伸100 s，共30個循環，72℃繼續延伸6 min。PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳，根據分子量大小初步鑒定。

1.2.3 pCMV-tag2b-NS4B重組質粒的構建及鑒定HindⅢ酶切pCMV-tag2b載體與目的基因PCR產物由In-Fusion重組酶進行連接，重組反應體系：目的片段 3 μl，pCMV-tag2b 1 μl，In-fusion 重組酶混合物 2 μl，ddH2O 4 μl，總體系為 10 μl，55℃反應30 min。反應產物轉化感受態DH5α大腸桿菌，在LB固體培養基上挑取數個單克隆菌落，篩選重組質粒提取其質粒，進行雙酶切鑒定，鑒定正確的質粒送至上海生工生物工程股份有限公司進一步測序鑒定。

1.2.4 細胞的復蘇、培養及轉染 將液氮中的U2OS細胞株取出，放入37℃水浴箱中快速攪動融化，置于3倍體積DMEM（高糖，含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素）培養基的無菌離心管中，1 500 r/min離心3 min，棄上清液，并加入含有DMEM培養基的細胞瓶中，于5%二氧化碳CO2、37℃孵箱中連續培養。當細胞匯合度達85%左右時，用0.25%胰酶消化傳代。轉染前，將U2OS細胞培養于細胞培養板/孔中，待匯合度達50%～60%時，按Lipofectamine 2000試劑盒說明書進行脂質體轉染。設置PCMV-tag2b空載體組和PCMV-tag2b-NS4B載體組，在轉染后48～72 h，進行后續實驗。

1.2.5 細胞凋亡檢測 U2OS細胞接種到細胞爬片上，按上述方法轉染相應質粒。轉染48 h后收樣，室溫下用PBS漂洗5～10 min/次，共3次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3次；再經0.3%TritonX-100通透處理10 min，PBS漂洗；DAPI染核，封片，熒光顯微鏡下觀察、拍照。凋亡細胞計數參照文獻[7]的方法進行。

1.2.6 Western blot檢測 細胞轉染pCMV-tag2b-NS4B 48 h后，用RIPA細胞裂解液裂解轉染細胞（設未轉染組為對照），抽提總蛋白，經Bradford法定量，加入5×上樣緩沖液煮沸備用；經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕轉法（200 mA，2 h）將蛋白轉印至PVDF膜上，根據蛋白分子量條帶剪下所需的膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h；抗Flag（1∶500比例稀釋）或α-tublin（1∶5 000比例稀釋）單克隆抗體4℃過夜，TBST漂洗5 min/次，共3次；再用HRP標記的抗鼠二抗（1∶2 000比例稀釋）孵育1.0～1.5 h，TBST漂洗5 min/次，共3次；混合ECL發光試劑顯色，用Fluor Chem FC2成像儀采集圖像。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 18.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 構建pCMV-tag2b-NS4B載體

本研究所用載體為pCMV-tag2b。構建策略為選用HindⅢ為內切酶，設計目的基因PCR引物時，在正、反向引物的5'-端分別添加16個與載體酶切位點上游同源的堿基序列，應用同源重組的原理將酶切的載體與PCR產物連接起來（見圖1）。首先擴增HCV NS4B基因，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳可見約780bp的特異性條帶（見圖2）；然后進行重組質粒的克隆。挑取獲得的細菌克隆擴增培養，提取質粒DNA，HindⅢ酶切，再經1%瓊脂糖凝膠電泳分析（見圖2）。酶切產物與PCR產物均在約750 bp處出現一條帶，與NS4B的片段長度接近，初步提示重組質粒克隆成功。

圖1 pCMV-Tag2b載體結構

圖2 pCMV-tag2b-NS4B重組質粒鑒定

2.2 pCMV-tag2b-NS4B質粒測序

將上述構建的重組質粒送上海生工生物工程股份有限公司測序，測序引物為CMV正向引物：CGCA AATGGGCGGTAGGCGTG（見圖3）。將結果序列與pJFH1 NS4Bb的標準序列進行比對，顯示匹配度為100%，表明成功構建NS4B真核表達質粒pCMV-tag 2b-NS4B。

2.3 NS4B蛋白在U2OS細胞中的表達

將U2OS細胞復蘇并在細胞瓶中培養（見圖4）。細胞轉染pCMV-tag2b-NS4B或pCMV-tag2b（同時設不轉染組對照）48 h后，收集細胞，經Western blot檢測U2OS細胞中NS4B蛋白的表達，結果顯示，只有在轉染PCMV-tag2b-NS4B載體的細胞（實驗組）中才表達NS4B蛋白（見圖5）。

2.4 NS4B蛋白誘導U2OS細胞凋亡

細胞轉染相應質粒48 h后，收集細胞，經DAPI染細胞核后在熒光顯微鏡下觀察，分別計數其凋亡情況。轉染pCMV-tag2b-NS4B組凋亡率為（17.25±2.95）%，轉染PCMV-tag2b組凋亡率為（6.53±2.36）%，經 t檢驗，差異有統計學意義（t=4.919，P=0.008）。見圖6。

圖3 pCMV-tag2b-NS4B重組質粒測序圖譜

圖4 U2OS細胞形態 （×20）

圖5 NS4B在U2OS細胞中的表達

圖6 HCV NS4B對細胞凋亡的影響 （×100）

3 討論

分子克隆是現代生命科學研究中最基本的技術方法之一，傳統的分子克隆通過雙酶切法把目的基因連接到載體上。該方法首先應用2種限制性內切酶分別切割目的基因和載體，產生帶有相同末端序列的目的基因片段和線性載體，然后用T4 DNA連接酶連接形成重組載體。最新發展起來的一種利用同源重組的原理進行分子克隆的方法，應用本方法設計引物時須在目的基因的2條引物5'-端添加15～20個與載體酶切位點上游同源的核苷酸序列，最后加入重組酶，可將酶切后的載體和目的基因連接到一起，產生重組質粒[8]。同源重組法跟雙酶切法相比，具有更加簡單、快速、克隆效率高等優點[9-10]。本研究是利用同源重組的方法克隆HCV NS4B的重組載體pCMV-tag2b-NS4B，經酶切和測序證明獲得的重組質粒正確無誤。Western blot檢測證明，本實驗構建的重組載體可以在U2OS細胞中正確表達目的基因產物NS4B蛋白。

本研究將PCMV-tag2b-NS4B載體轉染U2OS細胞，24 h后通過DAPI染細胞核，在熒光顯微鏡下觀察到明顯的細胞凋亡。這與ZHAO等[5]在293T細胞和Huh7細胞中的研究結果一致。RUTKOWSKI[11]和張艷妮等[12]發現，NS4B可通過誘導細胞的非折疊蛋白質反應而啟動細胞凋亡。李昌平等[13]在人正常LO2肝細胞中轉染表達NS4B后，胰島素樣生長因子IGF-Ⅱ表達上調，而抑癌基因P16表達下調，具有促進肝細胞增殖；此外，NS4B可能抑制Caspase-3表達、促進Survivin的表達而抑制肝細胞凋亡[13-14]；最近研究表明，NS4B可活化EOR-Ca2+-ROS-NF-κB，抑制HCV感染誘導的肝細胞凋亡[15]。各實驗室得出矛盾的結果其原因可能是所用的載體、細胞系等實驗條件不同所致，具體細節尚待進一步研究。

綜上所述，本實驗利用同源重組法成功構建HCV NS4B的真核表達載體，初步研究發現NS4B可誘導U2OS細胞凋亡，為后續進一步深入研究HCV NS4B的生物學功能奠定基礎。

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Construction of expression vector of HCV NS4B and its effect on cell apoptosis*

Bin-yu Song1,Jia-wei Zhao2,Jing Song3,Si-si Chen3,Zhi-ting Hu3,Xin Han3,Min-min Wang1,Lai-feng Ren3
(1.Science and Technology Center,Fenyang College,Shanxi Medical University,Fenyang,Shanxi 032200,China;2.Department of Clinical Medicine,School of Medicine,Xiamen University,Xiamen,Fujian 361002,China;3.Department of Laboratory Medicine,Fenyang College,Shanxi Medical University,Fenyang,,Shanxi 032200,China)

Objective To constructan eukaryotic expression vector ofHepatitis C virus (HCV)nonstructural protein NS4B,and investigate the effect of this protein on apoptosis of U2OS cells.Methods The fragment of target gene NS4B was obtained by PCR,and connected with the PCMV-tag2b vector using the homologous recombination method,and the PCMV-tag2b-NS4B was transformed into theE.coliDH5a.The right recombinant plasmid was selected.Lipofectamine 2000 was used to transfect PCMV-tag2b-NS4B into U2OS cells.Western blot was applied to detect the expression of HCV NS4B protein in U2OS cells,and immunofluorescence(IF)was used to assess the apoptosis of U2OS cells.Results The data showed that the recombinant plasmid PCMV-tag2b-NS4B was consistent with the one published on NCBI and could express HCV NS4B protein in U2OS cells.DAPI staining showed that the apoptosis rate of the PCMV-tag2b-NS4B group was(17.25±2.95)%and that of the control group was(6.53±2.36)%.Conclusions The eukaryotic expression vector of HCV NS4B has been successfully constructed,and HCV NS4B protein is expressed in U2OS cells and induces apoptosis.

Hepatitis C virus;nonstructural protein 4B;recombinant plasmid;apoptosis

R373.21

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.26.005

1005-8982（2017）26-0025-05

2016-12-26

山西省自然科學基金（No：2014021037-9）；山西省高等學校大學生創新創業訓練項目（No：2014052）；山西醫科大學汾陽學院科技發展基金（No：2016B02）

任來峰，E-mail：rlaifeng@163.com，Tel:15333434863

（童穎丹 編輯）