UPLC 法測定大鼠血漿中那格列奈的濃度及藥動學研究Δ

王凱，蔣大鵬，張偉，王淑梅（河北醫科大學第二醫院藥學部，石家莊050000）

UPLC 法測定大鼠血漿中那格列奈的濃度及藥動學研究Δ

王凱＊，蔣大鵬，張偉，王淑梅#（河北醫科大學第二醫院藥學部，石家莊050000）

目的：建立測定大鼠血漿中那格列奈濃度的方法，并研究其在大鼠體內的藥動學特征。方法：采用超高效液相色譜法（UPLC）。色譜柱為Acquity UPLC?BEH C18，流動相為乙腈-10 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖鹽溶液（41∶59，V/V），流速為0.38 mL/min，柱溫為35℃，檢測波長為210 nm，進樣量為2 μL。18只Wistar大鼠分別ig那格列奈16 mg/kg，分別于給藥前及給藥后10、20、30、45、60、90、120、180、240、360、480 min于眼內眥取血0.4 mL，測定血漿中那格列奈的濃度；并采用DAS 2.1.1軟件計算那格列奈藥動學參數。結果：那格列奈質量濃度在0.05～6.4 μg/mL范圍內線性關系良好（r＝0.999 3），定量下限為0.05 μg/mL；日內（n＝5）、日間（n＝3）精密度和穩定性（n＝3）試驗的RSD均小于10%；提取回收率和方法回收率分別為78.71%～80.56%、91.78%～100.42%（RSD＜10%，n＝5）。大鼠ig那格列奈后，AUC0-8h為（5.87±2.32）μg·h/mL，AUC0-∞為（6.11±2.48）μg·h/mL，t1/2為（1.72±0.55）h，tmax為（0.67±0.29）h，cmax為（3.34±1.23）μg/mL。結論：該方法準確快速、專屬性強，可用于大鼠體內那格列奈濃度的測定；那格列奈在大鼠體內吸收迅速、代謝較快。

那格列奈；超高效液相色譜法；藥動學；大鼠

那格列奈（Nateglinide）是用于治療2型糖尿病的非磺酰脲類口服降糖主流藥物之一[1]，可根據血液中葡萄糖水平調節胰島素分泌，改善胰島素初相分泌及糖化血紅蛋白水平。該藥具有起效快、作用時間短、組織選擇性高、與心肌和骨骼肌親和力低、不易引起低血糖反應等特點，能有效控制餐后血糖水平[2-3]；其安全性和有效性在2型糖尿病患者中得到驗證[4]，并被《中國2型糖尿病防治指南》推薦使用[5]。

由于那格列奈僅在210 nm波長左右有吸收峰[6]，故其檢測易受血漿內源性物質干擾。目前，國內外的研究多采用固相萃取聯合高效液相色譜法（HPLC）或高效液相色譜-質譜聯用法（HPLC-MS）測定血漿中那格列奈的濃度[7-10]，以減少雜質對其測定的干擾。但由于這些方法存在分析時間長、樣品處理方法煩瑣、成本較高等缺點，在實際應用中受到了很大限制。本研究擬采用液-液萃取聯合超高效液相色譜（UPLC）法，通過優化色譜條件，建立快速、可大批量測定大鼠血漿中那格列奈濃度的方法，并測定大鼠灌胃給予那格列奈后的經時血藥濃度，研究其在大鼠體內的藥動學，為其臨床血藥濃度監測提供新的方法學參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters AcQuity UPLC系統，包括恒溫自動進樣器、四元梯度泵、紫外檢測器、柱溫箱和Waters Empower 3操作平臺（美國Waters公司）；CPA 225D分析天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 藥品與試劑

那格列奈對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100619-200501，純度：99.5%）；那格列奈片（江蘇德源藥業有限公司，批號：13101052，規格：每片0.12 g）；格列齊特對照品（內標，中國食品藥品檢定研究院，批號：100269-201505，純度：99.5%）；乙腈、磷酸、磷酸二氫鉀、甲酸均為色譜純，乙醚、乙酸乙酯均為分析醇，水為蒸餾水。

1.3 動物

健康Wistar大鼠18只，♂，體質量220～240 g，購自河北省動物實驗中心，動物生產許可證號：SCXK（冀）-2013-1-003。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC?BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈-10 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖鹽溶液（41∶59，V/V，磷酸調節pH至4.25）；流速：0.38 mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：210 nm；進樣量：2 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 那格列奈系列對照品溶液的制備精密稱取那格列奈對照品10 mg，置于10 mL量瓶中，用41%乙腈溶液溶解、定容，制成質量濃度為1 mg/mL的對照品貯備液。分別精密量取對照品貯備液適量于量瓶中，用41%乙腈溶液制成質量濃度分別為64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg/mL的系列對照品溶液，4℃保存，待用。

2.2.2 內標標準工作液的制備精密稱取格列齊特對照品10 mg，置于10 mL量瓶中，用41%乙腈溶液溶解、定容，制成質量濃度為1 mg/mL的內標貯備液。精密量取內標貯備液適量于量瓶中，用41%乙腈溶液制成質量濃度為20 μg/mL的標準工作液，4℃保存，待用。

2.3 血漿樣品的處理

取血漿樣品，室溫下解凍后，離心（離心半徑為6 cm、10 900 r/min，下同）2 min。取上清液200 μL于5 mL離心管中，加入內標標準工作液20 μL、6‰甲酸溶液100 μL，渦旋30 s后加入乙醚-乙酸乙酯（70∶30，V/V）混合液1.5 mL，再渦旋2 min，離心3 min。取上清液于另一5 mL離心管中，40℃氮氣流下吹干后，用100 μL的41%乙腈溶液復溶，吸取2 μL進樣測定。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性取那格列奈對照品溶液（8 μg/mL）、內標標準工作液進樣；另取空白血漿和給藥后1 h大鼠血漿，分別按“2.3”項下方法處理后，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，在該色譜條件下，那格列奈、格列齊特峰形良好，保留時間分別為3.29、2.27 min；大鼠血漿中內源性物質對測定無干擾，各峰間分離度均大于1.5，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig1 HPLC chromatograms

2.4.2 標準曲線與定量下限取那格列奈系列對照品溶液各20 μL，置于40℃氮氣流下吹干，再分別加入空白血漿200 μL，制成質量濃度濃度分別為6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 μg/mL的系列那格列奈血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以那格列奈質量濃度為橫坐標（x）、那格列奈與內標格列齊特的峰面積的比值為縱坐標（y）進行線性回歸，得回歸方程為y＝0.718 6x－0.004 1（r＝0.999 3）。結果表明，那格列奈在質量濃度為0.05～6.4 μg/mL范圍內線性關系良好，定量下限為0.05 μg/mL。

2.4.3 準確度、提取回收率與精密度分別制備低、中、高質量濃度（0.1、0.8、5.8 μg/mL）血漿樣品，各5份，按“2.3”項下方法處理后，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄那格列奈峰面積Ai，根據標準曲線方程計算方法回收率。取等量對照品直接進樣測定，記錄峰面積Bi，則提取回收率（%）＝Ai/Bi×100%。按上述方法分別制備低、中、高濃度血漿樣品各5份，按“2.3”項下方法處理后，日內連續進樣5次，連續進樣3 d，分別考察日內、日間精密度。結果，方法回收率為91.78%～100.42%（RSD＜10%，n＝5），提取回收率為78.71%～80.56%（RSD＜10%，n＝5），日內（n＝5）、日間（n＝3）精密度試驗的RSD均小于10%。

2.4.4 穩定性取“2.4.3”項下低、中、高質量濃度血漿樣品，分別于室溫放置12 h、4℃進樣器內放置24 h、－40℃冷凍保存15 d、反復凍融3次，均平行3份，按“2.3”項下方法處理，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，上述各條件下穩定性試驗的RSD均小于10%（n＝3），表明樣品在上述條件下穩定性良好。

2.5 藥動學研究

將那格列奈片研成粉末，精密稱取粉末196.8 mg（相當于那格列奈40 mg），加入3‰羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液10 mL，制成質量濃度約為4 mg/mL的那格列奈混懸液。取18只Wistar大鼠，禁食不禁水12 h后，ig那格列奈混懸液16 mg/kg（給藥劑量根據體表面積法確定，為人用量的7倍）。分別于給藥前及給藥后10、20、30、45、60、90、120、180、240、360、480 min自眼內眥取血0.4 mL（自給藥120 min后，大鼠每次取血后均ig 0.4 mL生理鹽水補充體液），置于肝素化的1.5 mL離心管中，離心5 min，取上層血漿于離心管中，置于－40℃冰箱中保存，待測。動物實驗結束后，將待測血漿樣品于室溫下自然解凍，按“2.3”項下方法處理后，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，繪制血藥濃度-時間曲線。那格列奈在大鼠體內的藥-時曲線見圖2。

圖2 那格列奈在大鼠體內的藥-時曲線Fig2 Plasma concentration-time curve of nateglinide in rats in vivo

采用DAS 2.1.1藥動學軟件計算主要藥動學參數。結果，那格列奈在大鼠體內的AUC0-8h為（5.87±2.32）μg·h/mL，AUC0-∞為（6.11±2.48）μg·h/mL，t1/2為（1.72±0.55）h，tmax為（0.67±0.29）h，cmax為（3.34±1.23）μg/mL，CL為（3.17±1.69）L/（h·kg），V為（7.32±3.05）L/kg。

3 討論

在血漿樣品處理方法的篩選中，筆者嘗試了蛋白沉淀法和液-液萃取法。雖然蛋白沉淀法操作簡便，但雜質過多，而且處理后的樣品濃度會被稀釋，不利于檢測；采用乙酸乙酯進行提取，其靈敏度較低，難以滿足測定要求。劉茜等[11]采用乙醚作提取劑，提取回收率僅能達到60%左右；劉亮[12]采用異丙醇-二氯甲烷（80∶20，V/V）作提取劑，提取劑的使用量為3 mL。參閱上述文獻，經多次優化后，最終確定提取劑為乙醚-乙酸乙酯（70∶30，V/V）混合液。為了提高提取回收率，根據相似相溶原理，當化合物以分子形式存在時，更易溶于乙醚或乙酸乙酯。且陳毅挺等[13]研究表明，當pH小于2.5時，那格列奈基本以分子形式存在。故在加入提取劑前在血漿中加入6‰的甲酸溶液100 μL后，僅需要提取劑1.5 mL即可使提取回收率提高到80%左右。因此，與文獻報道的其他方法相比，該方法既提高了工作效率，又降低了成本。

在流動相選擇方面，為得到良好的峰形和較高的響應值，試驗中曾采用不同比例的乙腈-水、乙腈-甲酸水溶液作為流動相，但峰形均不理想。參閱文獻[8]，選用10 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液為水相，并用磷酸調節pH值。經多次優化篩選后，最終將流動相確定為乙腈-磷酸二氫鉀緩沖液（41∶59，V/V，磷酸調pH至4.25）。在內標選擇方面，筆者曾嘗試選用瑞格列奈，但在選定的色譜條件下其出峰時間與雜質重疊，測定受干擾；選用布洛芬作為內標，在選定的色譜條件下其保留時間較長（大于5 min）；而用格列齊特作為內標，保留時間適宜，與那格列奈分離完全，且峰形良好，無內源性物質干擾。

藥動學結果顯示，那格列奈口服吸收迅速、代謝較快，tmax為（0.67±0.29）h，t1/2為（1.72±0.51）h，這與文獻[11]報道基本一致。

綜上所述，本研究采用液-液萃取聯合UPLC法測定大鼠體內那格列奈濃度，操作簡便、分析時間短，可應用于大樣本的大鼠血漿中那格列奈濃度測定和藥動學研究，為今后人體內那格列奈與其他藥物的相互作用研究提供了方法學參考。

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Concentration Determination of Nateglinide in Rats’Plasma by UPLC and Study on Its Pharmacokinetics

WANG Kai，JIANG Dapeng，ZHANG Wei，WANG Shumei（Dept.of Pharmacy，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the concentration determination of nateglinide in rats’plasma and study its pharmacokinetic characteristics in rats in vivo.METHODS：UPLC was performed on the column of Acquity UPLC?BEH C18with mobile phase of acetonitrile-10 mmol/L potassium dihydrogen phosphate buffer（41∶59，V/V）at flow rate of 0.38 mL/min，with column temperature of 35℃，detection wavelength of 210 nm and volume of 2 μL.18 Wister rats were intragastrically administrated nateglinide 16 mg/kg.Blood sample 0.4 mL was taken from medial canthus before administration and after 10，20，30，45，60，90，120，180，240，360，480 min of administration.The concentration of nateglinide in rats’plasma was determined；then DAS 2.1.1 software was used to calculate its pharmacokinetic parameters.RESULTS：Nateglinide showed good linear relationship in 0.05-6.4 μg/mL（r＝0.999 3），lower limit of quantification was 0.05 μg/mL；RSDs of inter-day（n＝5），intra-day（n＝3）and stability（n＝3）tests were lower than 10%；extraction recovery rate and method recovery rate were 78.71%-80.56%，91.78%-100.42%（RSD＜10%，n＝5），respectively.After rats were intragastrically administrated nateglinide，AUC0-8hwas（5.87±2.32）μg·h/mL，AUC0-∞was（6.11±2.48）μg·h/mL，t1/2was（1.72±0.55）h，tmaxwas（0.67±0.29）h and cmaxwas（3.34±1.23）μg/mL.CONCLUSIONS：The method is accurate，rapid with strong specificity，and can be used for the concentration determination of nateglinide in rats in vivo；nateglinide is absorbed and metabolized quickly in rats in vivo.

Nateglinide；UPLC；Pharmacokinetics；Rats

R917

A

1001-0408（2017）31-4381-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.31.16

河北省藥學會2015年度臨床藥學專項科研項目（No.YX201505）

＊碩士研究生。研究方向：體內藥物分析。電話：0311-66003762。E-mail：691158182@qq.com

#通信作者：主任藥師，碩士生導師。研究方向：體內藥物分析和藥物相互作用。電話：0311-66002089。E-mail：shumei-wang@163.com

2016-12-26

2017-09-12）

（編輯：劉明偉）