白藜蘆醇對高血脂模型小鼠的預防作用和對模型金黃地鼠的改善作用研究

郜娜，楊慶宇（1.鄭州大學附屬腫瘤醫院/河南省腫瘤醫院藥學部，鄭州450008；.鄭州人民醫院藥學部，鄭州450053）

白藜蘆醇對高血脂模型小鼠的預防作用和對模型金黃地鼠的改善作用研究

郜娜1＊，楊慶宇2（1.鄭州大學附屬腫瘤醫院/河南省腫瘤醫院藥學部，鄭州450008；2.鄭州人民醫院藥學部，鄭州450053）

目的：研究白藜蘆醇對高血脂模型小鼠的預防作用和對模型金黃地鼠（以下簡稱地鼠）的改善作用。方法：以高脂高膽固醇飼料飼養誘導高血脂動物模型。將小鼠和地鼠均分為模型組和白藜蘆醇低、中、高劑量組（小鼠給予40、80、160 mg/kg，地鼠給予25、50、100 mg/kg），每組10只，同時設立10只相應動物為正常對照組。除正常對照組動物喂食正常飼料和ig生理鹽水外，其余小鼠在喂食高脂高膽固醇飼料的同時ig相應藥物；其余地鼠先建模2周，成模后再ig相應藥物，給藥期間繼續喂食高脂高膽固醇飼料。持續給藥4周，每周檢測各組小鼠和地鼠血清中總膽固醇（TC）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平，給藥4周后檢測各組小鼠和地鼠血清中前蛋白轉化酶枯草溶菌素9（PCSK9）mRNA及蛋白、微小RNA-27a（miRNA-27a）表達，以及小鼠肝組織中低密度脂蛋白受體（LDLR）蛋白表達。結果：與正常對照組比較，模型組小鼠從給藥2周后開始血清中TC、LDL-C、PCSK9 mRNA及蛋白、miRNA-27a水平均明顯升高（P＜0.05），肝組織中LDLR蛋白水平明顯降低（P＜0.05）；模型組地鼠給藥期間血清中TC、LDL-C、PCSK9 mRNA及蛋白、miRNA-27a水平均明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組小鼠和地鼠上述指標均明顯改善（P＜0.05），且與劑量呈正相關。結論：白藜蘆醇對高血脂模型小鼠有預防作用，對模型地鼠有改善作用。其機制可能是通過下調血清中miRNA-27a表達與PCSK9蛋白表達，進而升高肝組織中LDLR蛋白水平，最終降低血清中LDL-C水平。

白藜蘆醇；高血脂；小鼠；金黃地鼠；前蛋白轉化酶枯草溶菌素9；微小RNA-27a；低密度脂蛋白受體

心腦血管疾病是目前造成全球人口死亡的最重要原因之一。動脈粥樣硬化是造成心腦血管疾病的主要原因，其進程緩慢、發展隱匿，可以長期無任何癥狀，因此通常不容易引起人們的注意。但隨著動脈粥樣硬化的不斷發展，血管壁上沉積著的“小斑塊”逐漸增多、增大，堵塞血管，使血流變慢，嚴重時導致血流中斷[1]。血液中顯著升高的低密度脂蛋白膽固醇（Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平是動脈粥樣硬化的最主要誘因[2]。LDL-C受體（LDL-C receptor，LDLR）可將血液中多余的LDL-C轉移到肝等器官組織，維持血液中LDL-C穩態。有研究發現，前蛋白轉化酶枯草溶菌素9（Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）可與LDLR結合，并促使后者在溶酶體中降解，從而減少了靶器官中LDLR的水平及其循環時間，使得血液中高水平的LDL-C不能被及時移除，從而誘發高膽固醇血癥，最終誘發動脈粥樣硬化[2-3]。因此，PCSK9是降血脂及抗動脈粥樣硬化藥物開發的重要及熱門的靶點之一。

微小RNA（microRNAs，miRNAs）被證實在維持膽固醇穩態相關基因調節方面具有重要的作用，是針對高膽固醇血癥藥物開發的重要靶點[4]。miRNAs是一類由約22個核苷酸組成的單鏈RNA，可以調節相關基因的轉錄水平[5]。Alvarez ML等[6]研究表明，miRNA-27a在細胞水平上可以降低LDLR水平，使膽固醇代謝紊亂。

有研究表明，白藜蘆醇（Resveratrol）在高蔗糖飼養的模型大鼠中可降低血脂、增加機體抗氧化能力[7]。另有報道顯示，白藜蘆醇可改善胰島素抵抗，降低糖尿病模型小鼠的血糖和血脂。本研究以高脂高膽固醇飼料飼養小鼠及金黃地鼠（以下簡稱地鼠）建立高血脂模型，探討白藜蘆醇對模型小鼠的預防作用和對模型地鼠的改善作用，同時揭示其是否通過調節miRNA-27a/PCSK9通路影響LDLR水平，從而發揮維持膽固醇穩態的作用。

1 材料

1.1 儀器

CX31-P光學顯微鏡（日本Olympus公司）；XS205分析天平、MS12001L電子秤（瑞士Mettler Toledo公司）；Sorvall Legend Micro 17XS205低溫離心機、Multiskan FC酶標儀（美國Thermo公司）；CFX96熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）儀和Mini-PROTEAN?Tetra Cell蛋白電泳及顯影系統（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

白藜蘆醇（美國Sigma公司，批號：R5010，純度：99%）；高脂高膽固醇飼料（美國Research Diet公司，批號：D12336，成分：46%碳水化合物、16%脂肪、1.25%膽固醇）；總膽固醇（Total cholesterol，TC）和LDL-C試劑盒（南京建成生物工程研究所）；小鼠PCSK9酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（美國R&D公司）；LDLR抗體（美國Biovision公司）；兔抗地鼠PCSK9抗體（美國GenScript公司）；β-肌動蛋白（β-actin，美國Cell Signaling公司）；兔免疫球蛋白G（IgG）磁珠（美國eBioscience公司）。

1.3 動物

50只4～6周齡清潔級C57BL/6J小鼠，♂，體質量18～22 g；60只6～8周齡清潔級敘利亞金黃地鼠，♂，體質量80～100 g。動物均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號均為SCXK（京）2012-0001。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

2.1.1 小鼠所有小鼠飼養于清潔級環境中，保持環境濕度為55%～65%，溫度為25℃，并且維持12 h/12 h明暗交替。適應性喂養1周后，取40只小鼠隨機分為模型組和白藜蘆醇低、中、高劑量組，每組10只。模型組小鼠ig等體積生理鹽水；白藜蘆醇低、中、高劑量組小鼠分別ig 40、80、160 mg/kg的白藜蘆醇溶液。上述4組小鼠給藥期間以高脂高膽固醇飼料飼養直至實驗結束。另取10只小鼠飼以正常飼料，ig等體積生理鹽水，作為正常對照組。

2.1.2 地鼠所有地鼠飼養于清潔級環境中，保持環境濕度為55%～65%、溫度為25℃、12 h/12 h的明暗交替。適應性喂養1周后，取40只地鼠以高脂高膽固醇飼料飼養復制高血脂模型，2周后40只地鼠的LDL-C值均在3.87～7.69 mmol/L范圍內，隨后將其隨機分為模型組和白藜蘆醇低、中、高劑量組，每組10只。模型組地鼠ig等體積生理鹽水；白藜蘆醇低、中、高劑量組地鼠分別ig 25、50、100 mg/kg的白藜蘆醇溶液。上述4組地鼠給藥期間以高脂高膽固醇飼料飼養直至實驗結束。另取10只地鼠飼以正常飼料，ig等體積生理鹽水，作為正常對照組。

本實驗中，小鼠及地鼠給藥劑量均根據實驗室前期研究結果確定，給藥周期均為4周。

2.2 血樣采集與血脂檢測

各組小鼠及地鼠分別于給藥前（0周）和給藥1、2、3、4周后，禁食不禁水12 h，經眼底靜脈竇采血50 μL，1 500 r/min離心（離心半徑10 cm）15 min，取上層血清。按照試劑盒說明書分別檢測血清中TC和LDL-C水平。

2.3 血清中PCSK9 mRNA和miRNA-27a表達的檢測

末次給藥后，各組小鼠和地鼠均采用Trizol法抽提血清總RNA，進行反轉錄。反轉錄反應體系：總RNA 50～5 000 ng、隨機通用引物2μL，1 pmol/L、2×反轉錄反應體系混合物10μL，混合反轉錄酶1μL，加去RNA酶水至反應體系為20μL。反應條件：輕輕混勻，42℃孵育反轉錄30 min；85℃加熱5 min失活反轉錄酶，4℃冷卻。所得cDNA于－20℃保存，備用。采用RT-PCR檢測小鼠血清中PCSK9 mRNA、miRNA-27a表達與地鼠血清中PCSK9 mRNA表達，以U6作為內參。引物序列：小鼠miRNA-27a上游引物為5′-UUCACAGUGGCU-AAGUUCCGC-3′，下游引物為5′-UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC-3′，擴增長度為178 bp；小鼠PCSK9上游引物為5′-TTGCAGCAGCTGGGAACTT-3′，下游引物為5′-CCGACTGTGATGACCTCTGGA-3′，擴增長度為76 bp；地鼠PCSK9上游引物為5′-TGCTCCAGAGGTCATCACAG-3′，下游引物為5′-GTCCCACTCTGTGACATGAAG-3′，擴增長度為168 bp；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTGCG-3′，擴增長度為798 bp。PCR反應體系（20μL）：SYBR Green Mix染料9μL，cDNA模板2μL，上、下游引物各0.8μL（終濃度200 nmol/L），純水7.4μL。PCR反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，40個循環；72℃延伸10 min。以2－ΔΔct計算相對表達量，其中ct為目標擴增產物達到設定閾值所需的循環數。

2.4 血清中PCSK9蛋白表達的檢測

2.4.1 小鼠按小鼠PCSK9 ELISA試劑盒說明書操作，檢測各組小鼠末次給藥后血清中PCSK9蛋白含量。

2.4.2 地鼠由于無市售地鼠PCSK9 ELISA試劑盒，本研究參考文獻[8]中方法，以小鼠PCSK9 ELISA試劑盒檢測各組地鼠血清中PCSK9蛋白表達，同時采用Western blot法檢測地鼠血清中PCSK9蛋白表達進行驗證。取10 μL末次給藥后地鼠血清樣品，裂解、電泳轉膜后，加入2 μg PCSK9抗體，4℃下孵育1 h；加入50 μL兔IgG磁珠，4℃下持續緩慢振蕩過夜，離心棄上清，RIPA裂解液洗磁珠3次，再次離心；加100 μL十二烷基硫酸鈉（SDS）上樣緩沖液，充分渦旋后煮樣10 min；加入增強化學發光（ECL）試劑顯色，以β-actin為內參檢測PCSK9蛋白表達。

2.5 肝組織中LDLR蛋白表達檢測

取血結束后，處死小鼠，取肝組織50 mg，分別在0.5 mL蛋白裂解液中勻漿3次，每次間隔30 s。將勻漿液在4℃下3 000×g離心15 min，收集上清，4℃下12 000×g離心15 min，再次收集上清，即為總蛋白。采用Bradford法計算各樣本中蛋白濃度。蛋白樣品或免疫共沉淀收集的樣品經上樣緩沖液處理后，進行5%～15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），4℃下100 V電泳轉膜2 h。轉移膜經以5%TBST緩沖液稀釋的脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入LDLR抗體（稀釋比例為1∶1 000），4℃過夜，用TBST緩沖液振蕩沖洗3遍；加入二抗（稀釋比例為1∶2 000），室溫下孵育2 h，用TBST緩沖液振蕩沖洗3遍。轉移膜最后用ECL試劑顯色，凝膠成像儀拍照，Quantity One軟件分析。用樣品的吸光度與內參β-actin的吸光度的比值表示蛋白表達水平。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 小鼠和地鼠血清中TC及LDL-C

與正常對照組比較，模型組小鼠給藥1周后血清中TC、LDL-C水平均升高，但差異無統計學意義（P＞0.05），給藥2、3、4周后血清中TC、LDL-C水平均明顯升高（P＜0.05）；地鼠給藥1、2、3、4周后血清中TC、LDL-C水平均明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組小鼠和地鼠上述指標均明顯改善（P＜0.05），且與劑量呈正相關。給藥4周后，白藜蘆醇高劑量組地鼠血清中TC、LDL-C水平均趨于正常對照組水平。該結果提示，白藜蘆醇對高血脂小鼠有預防作用，對高血脂地鼠有改善作用。各組小鼠和地鼠給藥不同時間后血清中TC、LDL-C水平的測定結果見圖1。

3.2 小鼠和地鼠血清中PCSK9 mRNA

與正常對照組比較，模型組小鼠和地鼠血清中PCSK9 mRNA表達水平均明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組小鼠和地鼠血清中PCSK9 mRNA表達水平均明顯降低（P＜0.05），且與劑量呈正相關。各組小鼠和地鼠血清中PCSK9 mRNA表達的測定結果見圖2。

3.3 小鼠和地鼠血清中miRNA-27a

與正常對照組比較，模型組小鼠和地鼠血清中miRNA-27a表達水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組小鼠和地鼠血清中miRNA-27a表達水平明顯降低（P＜0.05），且與劑量呈正相關。各組小鼠和地鼠血清中miRNA-27a表達的測定結果見圖3。

3.4 小鼠和地鼠血清中PCSK9蛋白

圖2 各組小鼠和地鼠血清中PCSK9 mRNA表達的測定結果（±s，n＝10）Fig2 Results of PCSK9 mRNA expression in serum of mice and hamsters in each group（±s，n＝10）

圖3 各組小鼠和地鼠血清中miRNA-27a表達的測定結果（±s，n＝10）Fig3 Results of miRNA-27a expression in serum of mice and hamsters in each group（±s，n＝10）

與正常對照組比較，模型組小鼠和地鼠血清中PCSK9蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組小鼠和地鼠血清中PCSK9蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），且與劑量呈正相關。各組小鼠和地鼠血清中PCSK9蛋白含量的ELISA測定結果見圖4；各組地鼠血清中PCSK9蛋白表達的電泳圖見圖5，測定結果見圖6。

圖4 各組小鼠和地鼠血清中PCSK9蛋白含量的ELISA測定結果（±s，n＝10）Fig4 Results o f PCSK9 protein content in serum of mice and hamsters in each group by ELISA（±s，n＝10）

3.5 小鼠肝組織中LDLR蛋白

圖5 各組地鼠血清中PCSK9蛋白表達的電泳圖Fig5 Electrophoresis charts of PCSK9 protein expressionin serum of hamsters in each group

圖6 各組地鼠血清中PCSK9蛋白表達的測定結果（±s，n＝10）Fig6 Results of PCSK9 protein expression in serum of hamsters in each group（±s，n＝10）

與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織中LDLR蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組小鼠肝組織中LDLR蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.05），且與劑量呈正相關。各組小鼠肝組織中LDLR蛋白表達的電泳圖見圖7，測定結果見圖8。

圖7 各組小鼠肝組織中LDLR蛋白表達的電泳圖Fig7 Electrophoresis charts of LDLR protein expressionin liver tissue of mice in each group

圖8 各組小鼠肝組織中LDLR蛋白表達的測定結果（±s，n＝10）Fig8 Results of LDLR protein expression in liver tissue of mice in each group（±s，n＝10）

4 討論

目前已經證實多種miRNAs是膽固醇穩態轉錄后調節因子，包括miRNA-122、miRNA-370和miRNA-33。最新研究表明，miRNA-27家族（包括miRNA-27a和miR-NA-27b）是膽固醇和脂質代謝的關鍵調節因子。Choi JE等[9]研究表明，miRNA-27a可通過下調LDLR表達降低丙肝病毒的感染，并證實過表達miRNA-27a可以下調LDLR的表達。盡管其研究明確證實，miRNA-27a可以下調LDLR的表達，但是其沒有闡明miRNA-27a調節LDLR表達的具體作用機制。

PCSK9是一種新型的膽固醇穩態調節因子，其可在翻譯后調節LDLR水平。PCSK9主要由肝、小腸和腎分泌。在血漿中，PCSK9直接與肝臟LDLR胞外結構域表皮生長因子（EGF）-A結合，之后以PCSK9-LDLR復合體進入到細胞，LDLR在溶酶體內被降解，最終導致血清中LDL-C水平升高。在人體內，PCSK9功能獲得性突變可致高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化的發生；相反，PCSK9功能失去性突變可顯著降低血清中LDL-C水平，從而預防心腦血管疾病的發生。

本研究采用高脂高膽固醇飼料飼養誘導小鼠及地鼠高血脂模型，以考察白藜蘆醇對高血脂的防治作用。小鼠被廣泛地用于高血脂模型的復制，采用高脂或高脂高碳水化合物飼料長期飼養建立飲食誘導肥胖，小鼠會呈現明顯的高血脂、肥胖和葡萄糖耐量受損[10]。然而，小鼠體內的血漿載脂蛋白主要是高密度脂蛋白（HDL），而不同于人類（載脂蛋白主要是低密度脂蛋白），不能很好地模擬人類高血脂癥的病理特征[11]。近年來，敘利亞金黃地鼠被廣泛應用于脂蛋白代謝疾病的研究[12]，其主要載脂蛋白為非HDL，血漿中能表達膽固醇酯轉運蛋白（CETP），肝可通過LDLR介導LDL-C的攝取，肝和腸道可分別特定地產生載脂蛋白B-100，腸道可產生載脂蛋白B-48，其脂代謝譜與人類較為接近。當喂食富含膽固醇的飼料時，地鼠可快速發展成高血脂癥和高甘油三酯血癥，是研究脂代謝的理想動物模型。由本研究結果可以看出，白藜蘆醇可以顯著降低高血脂模型小鼠及地鼠血清中的TC、LDL-C和PCSK9 mRNA及蛋白水平，下調小鼠肝組織中LDLR蛋白表達；同時，白藜蘆醇能顯著降低高血脂模型小鼠及地鼠血清中miRNA-27a表達水平。由此可見，白藜蘆醇可通過下調血清miRNA-27a和PCSK9蛋白表達，進而升高肝LDLR蛋白水平，最終降低血清中LDL-C水平。

綜上所述，本研究結果顯示，白藜蘆醇下調miRNA-27a表達的同時降低PCSK9水平，增加LDLR蛋白表達，最終降低血清中LDL-C水平。以上結果證實白藜蘆醇是治療高脂血癥的有效藥物，具有很好的臨床開發前景。

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Study on the Preventive Effect of Resveratrol on Model Mice and Improvement Effect on Model Golden Hamsters with Hyperlipidemia

GAO Na1，YANG Qingyu2（1.Dept.of Pharmacy，the Affiliated Tumor Hospital of Zhengzhou University/Henan Cancer Hospital，Zhengzhou 450008，China；2.Dept.of Pharmacy，Zhengzhou People’s Hospital，Zhengzhou 450053，China）

OBJECTIVE：To study the preventive effect of resveratrol on model mice and improvement effect on model golden hamsters（shorter for hamsters）with hyperlipidemia.METHODS：Hyperlipidemia animal models were induced by using high-fat and high-cholesterol diet.Mice and hamsters were both randomly divided into model group and resveratrol low-dose，medium-dose，highdose groups（40，80，160 mg/kg for mice，25，50，100 mg/kg for hamsters），10 in each group.10 corresponding animals were selected as normal control group.Except that normal control group was fed normal diet and intragastrically administrated normal saline，other mice were intragastrically administrated relevant medicines when fed high-fat and high-cholesterol diet；other hamsters were firstly modeled for 2 weeks and intragastrically administrated relevant medicines after modeling.High-fat and high-cholesterol diet was fed during administration.It was administrated for 4 weeks.Total cholesterol（TC）and low density lipoprotein cholesterol（LDL-C）levels in serum of mice and hamsters were detected every week.After 4 weeks，pre-protein converting enzyme subtilisin 9（PCSK9）mRNA and protein expression，microRNA-27a（miRNA-27a）expression in serum of mice and hamsters，and low density lipoprotein receptor（LDLR）protein expression in liver tissue of mice were detected.RESULTS：Compared with normal control group，the TC，LDL-C，PCSK9 mRNA and protein，miRNA-27a levels of mice in model group were obviously increased after 2 weeks of administration（P＜0.05）；LDLR protein level in liver tissue was obviously decreased（P＜0.05）.TC，LDL-C，PCSK9 mRNA and protein，miRNA-27a levels of hamsters in model group were obviously increased（P＜0.05）.Compared with model group，above-mentioned indexes of mice and hamsters in each administration group were obviously improved（P＜0.05），which were positively correlated with dose.CONCLUSIONS：Resveratrol has preventive effect on model mice and improvement effect on model golden hamsters with hyperlipidemia.The mechanism may be down-regulating miRNA-27a expression and PCSK9 protein expression in serum，to increase LDLR protein level in liver tissue，and finally reduce LDL-C level.

Resveratrol；Hyperlipidemia；Mice；Golden hamsters；Pre-protein converting enzyme subtilisin 9；MicroRNA-27a；Low density lipoprotein receptor

R965；R972+.6

A

1001-0408（2017）31-4393-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.31.19

＊主管藥師。研究方向：醫院藥學。電話：0371-65587016。E-mail：gaona6677@126.com

2017-03-26

2017-06-27）

（編輯：鄒麗娟）